一种用于删除植物中的DNA区的方法。在一些实施方案中，该方法包括用核酸分子转化植物，其中所述核酸分子编码与一种或多种组织特异性启动子，例如花粉特异性启动子可操作连接的一种或多种锌指核酸酶(ZFN)。方法包括切除植物中的天然基因。因而，在一些实施方案中，工程化改造识别在天然植物基因侧翼的序列的ZFN。在又一些实施方案中，将ZFN在发育阶段特异性启动子的控制下表达，使得例如在相对晚期的发育阶段期间在植物中特异性切除核酸序列。包括可用于实施公开的方法的核酸分子和由该方法生成的植物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
一般而言，本专利技术涉及用于生成转基因植物的组合物和方法。在某些实施方案中，转基因植物包含一种或多种感兴趣的转基因。在某些实施方案中，在花粉和/或种子中指导转基因的切除，使得由本专利技术的转基因植物生成的花粉和/或种子基本上没有转基因。在一些实施方案中，例如，本专利技术的转基因植物可用于实现感兴趣的转基因在转基因植物中的生物限制(bioconfinement)。在其它实施方案中，转基因的切除针对特定表达盒,诸如选择标志，使得仅自转基因植物和/或转基因植物后代除去此表达盒。
技术介绍
许多植物用来自其它物种的基因遗传转化以导入期望的性状，诸如以经由例如改善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性；实现自植物生成工业上有用的化合物和/或材料；和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育转基因植物的回收可以用于进行植物的此类修饰，并且已经容许经由遗传工程(例如作物改良)将期望的感兴趣的性状或质量掺入植物中。在这些方法中，通常将外来DNA导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，以生成经稳定转化的植物细胞。关于使用转基因植物出现的一项缺点是转基因逃脱至野生物种和非转化物种的可能性。这些性状可以增加异型杂交、持久性、和转基因对邻近群体的基因渗入(introgression)的风险。转基因自遗传改良(GM)作物的逃脱通常经由基因流动，主要通过异花传粉发生(Lu(2003)Eviron. Biosafety Res. 2:3-8),但是也可以经由基因渗入发生。Stewart Jr.等(2003)Nat. Reviews Gen. 4:806-17。作物间基因流动会导致对非 GM品种(variety)的污染，影响给定农业系统中转基因和非转基因作物品种的策略开发。用转基因材料对非GM作物的显著污染由于许多国家对转基因产品进口的法律限制而在国际贸易中造成困难。若转基因赋予多种抗性(例如，针对除草剂、有害物和/或疾病)，则作物间基因流动可以引起转基因在可能潜在地变为自生杂草的杂种中叠加。另外，作物间基因流动会导致转基因逃脱至杂草似的群体或相关野生物种中，若转基因经由有性生殖和/或无性繁殖在杂草似的/野生的群体中持续并建立，则这会造成严重的杂草问题和其它生态学风险。这在逃脱的基因增强杂草似的/野生的物种的生态学适合度时是一项特别的忧虑。作物转基因的基因渗入在牵涉几个连续杂种世代的步骤中发生。基因渗入是一种动态过程，其在转基因在接受物种的遗传背景中固定前可能花费多年和多代，并且如此呈现检测和监测的困难。然而，若选择是强的和/或群体大小较小，则可以快速发生基因渗入基因的固定。遗传修饰植物内特定表达盒，尤其是选择标志表达盒的污染是一项易忘的目的。选择标志基因通常抗生素抗性或除草剂耐受性基因，但是可以包括报告基因(即，葡糖醛酸糖苷酶(Graham 等(1989) Plant Cell Tiss. Org. 20 (I) : 35-39)。共转移入植物的基因组中的选择标志提供选择优势，并且容许鉴定经稳定转化的转基因植物。可以用于转化植物的功能性选择标志基因的利用度稍微受到限制。发表的关于转基因作物植物的科学文献的综述揭示了抗生素抗性的最广泛使用的选择剂是卡那霉素(由新霉素磷酸转移酶II型基因编码(Bevan等(1983)Nature 304:184-187))或潮霉素(由潮霉素磷酸转移酶基因编码(Waldron等，Plant Mol. Biol. 5:103-108))，并且除草剂耐受性是草胺勝(phosphinothricin)抗性(由 pat (Wohlleben 等(1988) Gene 70:25-37)或 bar 基因(DeBlock 等(1987), EMBO J. 6 (9) :2513-2518)编码)。见 Sundar 等(2008) J. PlantPhysiol. 165:1698-1716。鉴于有限数目的选择标志基因和通常使用这些性状的亚组，容许切除并再使用转基因植物内的选择标志的解决办法会消除在对同一植物的基因转移或基因叠加的后续轮次中对其它选择标志的需要。此外，切除选择标志的能力可以克服对植物转录物组(transcriptome)的无意改变,其通过表达标志物引起(Abdeen等(2009)PlantBiotechnol. J. 7(3):211-218)。 目前用于阻止GM作物与其它物种和品种间的基因流动或使其最小化的策略包括(1)物理分离转基因作物；(2)转基因的叶绿体工程化；(3)缓解基因(mitigationgene)及转基因的共工程化改造；(4)遗传用途限制技术(genetic use restrictiontechnology, GURT) ； (5) CRE/loxP和FLP/FRT重组酶介导的基因删除。见例如Lee和Natesan (2006) TRENDS Biotech. 24 (3) : 10914; Lu (2003),见上文；及 Luo 等(2007), PlantBiotech. J. 5:263-74;和(6)大范围核酸酶介导的基因删除。见例如美国专利申请No. 11/910, 515 ;和美国专利申请 No. 12/600,902。已经利用CRE、FLP、和R重组酶自植物切除不想要的遗传物质。Hare和Chua(2002)Nat. Biotech. 20:575-80。Luo等(2007)，见上文报告了花粉和种子特异性“GM基因删除物(deletor) ”系统，其中使用IoxP FRT融合序列作为CRE或FLP重组酶切除转基因的识别位点导致转基因自转基因烟草植物的花粉或自花粉和种子两者的删除。显示在植物中发挥功能的所有这些位点特异性重组酶系统是整合酶家族的成员。至少部分由于其它重组酶可能需要辅助蛋白和可以对重组效率赋予拓扑学限制的更复杂的识别位点的实情，已经选择这些系统进行使用。同上文。这些系统具有几个重大的缺点整合酶型重组酶也可以识别“假序列”，其可以与特定的靶序列高度趋异，并且因此导致不想要的非特异性DNA删除；并且靶序列的切除留下残留的识别序列，其可以是后续暴露于重组酶后染色体重排的位点，或者激活基因沉默机制。同上文。此外，这些系统进一步受到限制，因为必须存在功能性重组酶，并且其在亲本植物之一中表达，其存在需要花粉和/或种子内删除的其它策略。尽管有这些限制，CRE/loxP系统被认为是用于优化植物中的基因删除的最合适的策略。同上文。定制设计的锌指核酸酶(ZFN)是为了递送DNA中靶定位点特异性双链断裂，随后重组切割末端设计的蛋白质。ZFN组合FokI限制性内切核酸酶的非特异性切割域与锋指 DNA 结合蛋白。见例如 Huang 等(1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20 ; Kim 等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1156-60;Kim 等(19本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.22 US 61/297,6281.一种用于删除植物中的DNA区的方法，该方法包括 提供含有基因组DNA的能活植物，该基因组DNA包含所述DNA区；并在含有所述基因组DNA的所述能活植物中导入或表达锌指核酸酶，其中将所述锌指核酸酶工程化改造为在识别序列处切割所述基因组DNA ； 其中所述方法导致在识别序列处对所述基因组DNA的切割，而且导致所述基因组DNA的切除，其中所述DNA区不存在于所述基因组DNA。2.通过权利要求I的方法生成的转基因植物。3.一种用于删除植物中的DNA区的方法，该方法包括 提供含有基因组DNA的第一能活植物，所述基因组DNA包含所述DNA区及在所述DNA区的3’端侧翼的第一识别序列和在5’端侧翼的第二识别序列； 提供含有基因组DNA的第二能活植物，所述基因组DNA包含编码工程化改造为在所述识别序列处切割所述基因组DNA的锌指核酸酶的DNA; 将所述第一和第二能活植物杂交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成Fl种子；并 种植含有基因组DNA的所得Fl植物，其中所述DNA区不存在于所述基因组DNA。4.权利要求3的方法，其中所述第一识别序列和所述第二识别序列是相同的。5.由权利要求3的方法生成的转基因植物。6.一种分离的核酸分子，其包含 由锌指核酸酶识别的第一核酸序列； 感兴趣的基因；和 由锌指核酸酶识别的第二核酸序列，其中所述感兴趣的基因侧翼有由锌指核酸酶识别的所述第一和第二核酸序列。7.权利要求6的分离的核酸分子，其进一步包含与所述感兴趣的基因可操作连接的启动子。8.权利要求6的分离的核酸分子，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列侧翼有同源序列。9.一种生成转基因植物的方法，包括 用权利要求I的分离的核酸分子转化植物细胞或植物组织；并 再生全植物。10.由权利要求9的方法生成的转基因植物。11.一种分离的核酸分子，其包含 启动子；和 编码锌指核...
【专利技术属性】
技术研发人员：S拉塞尔，JF佩托里诺，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：
国别省市：
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