一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法。本发明专利技术提供的载体包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。将阳性转染的细胞作为供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚培养至36h时，诱导表达牛KDM4B和KDM4C。本发明专利技术可以有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物体细胞克隆
，涉及一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提 高牛克隆效率的载体、细胞及方法。
技术介绍
体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病 模型，人类器官移植，动物转基因研究，濒临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。 但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。 目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重 编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传 修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化和DNA甲基化两方面。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率 的载体、细胞及方法，在牛体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合后的细胞 进行处理，诱导牛KDM4B和KDM4C蛋白的表达，提高牛体细胞克隆囊胚质量和发育率。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： -种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，包括阻遏物表达载体 和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中； 所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体； 所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因 TetO的载体，其中插入 携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。 还在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加 Kozak序列、EGFP标签和酶切位点； 其中，牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示； 牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ. ID. N0.2所示。 所述的阻遏物表达载体为pCMV_Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR; 所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵 基因 TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列， 其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。 -种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，以牛胎儿成纤维细胞 为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞;通过与 阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为 核供体细胞； 所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体;所述的含有阻遏 操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因 TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B 或KDM4C基因的读码框。所述的转染为电击转染； 将阻遏物表达载体pCMV-Tet3G和含有阻遏操纵子的表达载体和PTRE3G-EGFP-KDM4B/C按4:1的质量比电击共转染； 所述的PTRE3G-EGFP-KDM4B/C是在PTRE3G-BI载体多克隆位点中克隆2个拷贝的 KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接； 所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100~200ng/mL; 所述的表达载体阳性表达的细胞激发后发出绿色荧光。 -种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，包括以下步骤： 1)分别构建携有荧光标签的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体，并将 所构建的载体与可诱导表达的载体通过电击共转化胎牛原代成纤维细胞，筛选出细胞克 隆，加入诱导表达药物对牛KDM4B基因或KDM4C基因进行诱导表达，挑取可被荧光激发的阳 性细胞克隆作为体细胞核移植的牛供体细胞； 2)将所制备的牛供体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后 lh，挑选电融合的融合细胞进行以下激活处理:2~5ymol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵 育4~lOmin，然后转移到1~2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5°C、5 %C02、饱和湿度条 件下培养4~10h; 所述的mSOF溶液是以S0F培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2%的BME、体 积分数1 %的MEM、体积分数1 %的ITS、lmmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉 素和0. lmg/mL的链霉素； 3)在进行激活处理后，转移到G1.5培养液中，在38.5°C、5%C02、饱和湿度条件下 培养4h，再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至36h;再转移到含200ng/mL 诱导表达药物的G1.5培养液中培养至60h，诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达;最后转移到 G2.5培养液中继续在38.5°C、5%C02、饱和湿度条件下培养至第7d。 所述的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C， 其含有四环素操纵基因 TetO,并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝 均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；所述的可诱导表达的载体为pCMV_Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR; 在共转化胎牛原代成纤维细胞时，载体pTRE3G-EGFP-KDM4B/C与pCMV-Tet3G的质 量比为4:1; 所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100~200ng/mL。 所述诱导表达药物诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达时，诱导表达时段选在细胞 融合后第36h~60h; 所述的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在C02培养箱中平衡至少2h;G1.5培 养液中，液滴大小为120~150yL，每个液滴中放18~20枚牛体细胞克隆胚。 所述的去核的卵母细胞的制备为： 在去核前，卵母细胞先在含有7 · 5μg/ml细胞松弛素 B、10μg/ml Hoechst33342和体 积浓度10%FBS的PBS溶液中孵育15min;然后在显微操仪下，用内径为20μπι的去核管吸取第 一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况;完全去除第一极体 及染色体的卵母细胞应用于核移植； 所述的电融合的操作为： 挑选直径为15~20μπι的待移植的牛供体细胞，注入到去核的卵母细胞透明带下； 在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min;将重构体的供体、作为受体的去核的卵 母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时为20ys、2次脉冲间隔 10ms〇 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： 本专利技术提供的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方 法，是基于甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰。牛KDM4B和KDM4C蛋白是专一性去除组 蛋白H3赖氨酸K9的3甲基化(H3K9me 3)表观遗传修饰的去甲基化酶，将牛KDM4B或牛KDM4C基 因构建于含有阻遏操纵子的表达载体，并将其与阻遏物表达载体共转染核供体细胞，这样 就可以在特定的阶段通过药物诱导去阻遏，从而达到去甲基化的表观遗传修饰。通过在体 细胞克隆胚合子激活时期（8细胞至桑椹胚时期）之前诱导表达牛KDM4B或牛KDM4C蛋白，可 有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，其特征在于，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张涌，刘鑫，苏建民，高明清，王勇胜，孙洪政，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61