公开了基于ＤＮＡ的、利用扩增引物或探针检测、鉴定和定量测定测试样品中下述来源的ＤＮＡ的方法：（ｉ）任何细菌，（ｉｉ）无乳链球菌、腐生葡萄球菌、屎肠球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、单核细胞增生利斯特氏菌和白假丝酵母，为（ｉｉｉ）链球菌、葡萄球菌、肠球菌、奈瑟氏球菌和假丝酵母各属的任何种类。也公开了基于ＤＮＡ的、利用扩增引物或探针检测、鉴定和定量测定测试样品中选自下述的抗生素抗性基因的方法：ｂｌａ↓［ｔｅｍ］、ｂｌａ↓［ｓｈｖ］、ｂｌａ↓［ｒｏｂ］、ｂｌａ↓［ｏｘａ］、ｂｌａＺ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃ６’－ＩＩａ、ａａｃＡ４、ａａｄ（６’）、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｍｓｒＡ、ｓａｔＡ、ａａｃ（６’）－ａｐｈ（２”）、ｖａｔ、ｖｇａ、ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｅｃＡ、ｉｎｔ和ｓｕｌ。上述微生物种、属和抗性基因均是多种临床标本中临床相关的和常见的，这些基于ＤＮＡ的检测法比较快速、准确，可以用于临床微生物为实验室中进行常规诊断。这些新型方法应可用于提高微生物感染诊断的速度和准确度，因此可以达到更有效的治疗。也要求了用于（ｉ）细菌的通用检测和定量测定，和／或（ｉｉ）上述细菌和真菌种和／或属的检测，鉴定和定量测定，和／或（ｉｉｉ）上述抗生素抗性基因的检测，鉴定和定量测定的诊断试剂盒。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
用于细菌鉴定和敏感性试验的传统方法在过去，通常是使用例如API20ETM系统(bioMe′rieux)等生物测试方法，根据细菌利用不同的底物作为碳和氮源的能力来鉴定细菌的。就敏感性试验来说，临床微生物学实验室使用的方法包括平板扩散、琼脂稀释和肉汤微量稀释法。虽然基于生物化学试验和抗菌敏感性试验的鉴定方法是有效的，但由于需要鉴定临床样品中的细菌及确定其对抗微生物药剂的敏感性而必须经过连续两次过夜培养，所以至少要用两天时间才能得到初步鉴定结果。为进行快速微生物鉴定和敏感性试验，已有一些市售的使用高级和贵重装置的自动检测系统(即Dade DiagnoticsCorp.的MicroScan系统和bioMe′rieux的Vitek系统)(Stager andDavis，临床微生物综述，5302-327)。这些系统需要较短的保温时间，因而可在不到6小时的时间内完成大多数细菌鉴定和敏感性试验。然而，这些快速系统总是需要首先将细菌分离成纯培养物，这一过程对于纯培养物要花费至少18小时，对于混合培养物则需2天时间。最快的鉴定系统是auto SCAN-Walk-AwayTM系统(Date DiganosticsCorp.)，其可在2小时内从标准化接种物中鉴定出革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，并在5.5小时内得到对大多数抗生素的敏感性模式。然而，该系统对肠细菌以外菌种的非确定性鉴定的比例特别高(即3.3至40.5％)。对肠细菌的非确定性鉴定比例为2.7至11.4％(CroizeJ.，1995，Lett.Infectiol.，10109-113；York等，1992，临床微生物学杂志，302903-2910)。在微生物学实验室中可常规分离并鉴定临床样品中的各种细菌和真菌。表1和2中列出了各种类型临床样品中最常分离到的细菌和真菌病原体的出现率。这些病原体常常与人们在医院和公共场所获得的感染有关，因而被认为是最具临床重要性的。在临床微生物学实验室中检测的临床样品临床微生物学实验室中收到的大多数样品是尿样和血样。在I′Universite′Laval中心医院(CHUL)的微生物学实验室中，尿样和血样分别占收到样品的大约55％和30％(表3)。剩下15％的临床样品包括各种生物液体，包括痰、脓、脑脊液、滑液等(表3)。尿道、呼吸道和血流感染通常是由细菌所致，需要抗微生物治疗。事实上，对临床微生物学实验室中收到的所有临床样品的检测通常是鉴定细菌和敏感性测试。临床样品中常规病原体的鉴定尿样对尿样中病原体的检查在常规微生物学实验室中非常普遍，已经开发出了许多测试方法。然而，通用的标准仍然是经典的半定量性平板培养物方法，其中将1μl尿液在平板上划线，并培养18-24小时。然后对菌落计数以确定每升尿液中菌落形成单位(CFU)的总数。细菌尿道感染(UTI)通常与尿液中细菌数为107CFU/L或更高有关。然而，尿液中细菌数为107CFU/L以下时也有可能造成感染，对于易患病或插入了导管的那些患者尤为如此(Stark和Maki，1984，新英格兰医学杂志，311560-564)。重要的是，临床微生物学实验室中检测的约80％的尿样被视为是阴性的(即细菌计数小于107CFU/L；表3)。利用标准生化测试方法对经培养物鉴定为阳性的尿样进一步鉴定以鉴别细菌病原体，还检测其对抗生素的敏感性。这种生化和敏感性测试通常需要18-24小时的培养时间。细菌病原体的准确和快速尿液筛选方法可使得更快速地鉴定出阴性样品，并更有效地治疗和护理患者。已将数种快速鉴别方法(UriscreenTM，UTIscreenTM，Flash TrackTMDNA探针等)与基于细菌病原体培养物的更慢的标准生化方法进行了比较。这些快速测试方法虽然更为快速，但灵敏度较低，特异性也较差，而且假阴性和假阳性结果也很多(Koening等，1992，临床微生物学杂志，30342-345；Pezzlo等，1992，临床微生物学杂志，30640-684)。血样对微生物学实验室中收到的血样常常进行培养。血液培养物系统可以是人工的、半自动的或完全自动的。BACTEC系统(BectonDickinson)和BacTALert系统(Organon Teknika公司)是最为广泛使用的两种自动化血液培养系统。这些系统将血液培养瓶置于细菌生长最佳条件下培养。利用高灵敏性细菌生长检测仪连续地监测细菌的生长，以便检测出早期阳性。一旦检测到细菌生长，即直接对血液培养物进行革兰氏染色，然后用于接种营养琼脂平板。随后，用前述的自动化系统，对分离的细菌菌落进行细菌鉴定和敏感性测试。如果培养6-7天后未检测到病原体生长，通常将这种培养瓶报告为阴性。正常情况下，绝大部分血液培养物报道为阴性。例如，CHUL的微生物学实验室在1994年2月至1995年1月期间阴性血液培养物的比例为93.1％(表3)。其他临床样品在由临床微生物学实验室接受后，处理除血液和尿液以外的正常情况下得自无菌部位的所有其他体液(即脑脊液、滑液、胸腔液、心包液等)以进行直接显微镜检查和继后培养。同样，大多数临床样品都是培养阴性的(表3)。对于那些并非得自无菌部位的临床样品，如痰和粪便样品来说，由于有正常菌群污染，所以用培养法进行实验诊断的问题较多。从污染物中纯化出可能与感染相关的细菌病原体，然后按以前描述的方法进行鉴定。当然，细菌的常用检测法并不适用于诊断这些非无菌部位的细菌感染。另一方面，用于这些样品的种或属的检测和鉴定及抗生素抗性基因检测的基于DNA的试验应是很有用的，并且相比于传统的细菌鉴定和敏感性试验方法有多个优点。用任何临床样品进行的基于DNA的检测法显然需要建立由临床样品直接检测和鉴定细菌的快速和准确的诊断试验。基于DNA的技术迅速而且准确，并且可能大大改善对传染性疾病的诊断(Persing et al.，1993，诊断分子生物学原理与应用，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。作为本专利技术主题的DNA探针和扩增引物适用于直接从血液培养物、血液、尿液、痰、脑脊液、脓及其他标本(表3)等任何一种临床标本检测并鉴定细菌或真菌。从迅速和准确的角度看，本专利技术中提出的基于DNA的试验优于目前微生物学实验室用于由任何临床样品进行常规诊断的标准生化方法。因为这些试验只在大约1小时内完成，所以它们为临床医生提供了新的诊断工具，从而有利于提高抗微生物剂的治疗效率。也可用这些检测法测试得自人以外生物体(例如其它灵长类、鸟类、植物、哺乳动物、农场动物、家畜等)的临床标本。高百分比的培养阴性标本在所接受的用于常规诊断的所有临床标本中，大约80％的尿样和更多(约95％)的其他类型临床标本都是细菌病原体阴性的(表3)。除了在种或属水平上鉴定给定标本中的细菌外，还希望用检测任何细菌存在的试验(即通用细菌检测)筛选出高比例的阴性临床标本。这样一种筛选试验可以是基于对所有细菌中的高保守的基因靶进行的DNA的PCR扩增。细菌阴性的标本不会被此检测法扩增。另一方面，细菌阳性的那些标本用此检测法检测会得到阳性扩增信号。发展基于DNA的快速诊断试验快速诊断试验对处理感染将具有重要影响。DNA探针和DNA扩增技术比鉴定本文档来自技高网...
【技术保护点】
使用特异性、普遍适用并灵敏的探针和／或扩增引物从怀疑含有下述细菌和／或真菌核酸的任何样品中确定下列来源的核酸的存在和／或量的方法：－选自下列组中的抗生素抗性基因：ｂｌａ↓［ｔｅｍ］、ｂｌａ↓［ｓｈｖ］、ｂｌａ↓［ｒｏｂ］、ｂｌａ↓［ｏｘ ａ］、ｂｌａＺ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃ６′－Ⅱａ、ａａｃＡ４、ａａｄ（６′）、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ、ｍｓｒＡ、ｓａｔＡ、ａａｃ（６′）－ａｐｈ（２″）、ｖａｔ、ｖｇａ、ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｅｃＡ、ｉｎｔ和ｓｕｌ，以及－选自下列组中的特定细菌和真菌菌种：屎肠球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、白假丝酵母、肠球菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属、链球菌属和假丝酵母属，其中所述每一种核酸或其变体或其部分包 含可与所述探针或引物杂交的选定靶区域；所述方法包括下列步骤：在杂交或扩增的相同条件下使所述样品与所述探针或引物接触，并检测已杂交的探针或扩增产物的存在和／或量，以作为所述特定细菌和／或真菌菌种或属，同时还有所述细菌抗生素抗性基因的存在和 ／或量的指征。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：MG伯吉罗恩，FJ皮卡德，M奥莱特，PH罗伊，
申请(专利权)人：感染诊断IDI公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]
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