本发明专利技术公开了一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，该方法是提取细菌的总DNA作为模板，SEQIDNO:1~2所示序列为引物，PCR扩增和16SrDNA序列分析鉴定菌株，同时以SEQIDNO:3~8所示序列为引物，进行测序鉴定，检测带有抗性基因的抗性菌株。本发明专利技术的方法针对水产养殖生物和养殖环境中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效，DNA提取无需使用特殊试剂，也无需用酚和氯仿等有毒试剂，安全环保，价格低廉，步骤简单，耗时短，结果稳定可靠，PCR产物的扩增阳性率高。运用16SrDNA鉴定菌种和检测抗性基因，DNA图谱信息度高、实用性强、简便快速，结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景、有很高的理论研究意义和实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
近年来由于抗生素在养殖业和畜牧业中的大量使用，导致其对环境污染的问题日趋严重，已成为当前国际上的研究热点之一。我国是世界第一水产养殖大国，但近年来由于水产养殖污染加剧，造成养殖环境质量不断恶化，病原生物种类增多和传播速度加快，养殖病害日趋严重，水产养殖中的病害问题特别是细菌性病害在密集型养殖系统中发生频繁且影响严重，这极大地限制了我国水产养殖业的发展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素类药物，抗生素作为饲料添加剂在动物养殖业中使用非常普遍。抗生素的长期滥用很可能会诱导动物体内产生抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes, ARGs), ARGs 经排泄后将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染。随着抗生素类药物不断的大量使用，许多细菌都有了耐药性，且情况日益严重，抗生素抗性基因已经成为一种新型的环境污染物。目前在不同的环境介质如水体沉积物水生生物和细菌体内等均已检出AR(}S的存在， 并且有研究还发现AR(is能够通过可移动的遗传元件(Genetic mobile elements)在细菌之间传播，进而在环境中扩散，这将会对公共健康和食品安全构成严重的威胁。针对水产养殖业大量使用抗生素这一现状，开展渔业环境抗生素抗性基因污染的研究，建立水产养殖生物和养殖环境抗生素抗性菌株筛选和鉴定方法，揭示抗生素抗性基因在渔业环境中的扩散和传播规律，对于评价抗生素抗性基因的生态风险十分必要。不仅能确保我国水产养殖业的健康可持续发展，而且对于我国的生态安全和经济发展具有重要的现实意义。目前，人们普遍认为抗生素对环境微生物的耐药性的选择和诱导可能是其环境效应最重要的部分。抗生素对耐药菌株抗性基因ARGs的诱导具专一性，因此可以认为抗生素本身在环境中的迁移、转化及归趋等环境行为与其所诱导的抗生素抗性基因在环境中的广泛传播在理论上应该具有很大的相似性和一致性。己有一些研究证实了抗性基因的存在与抗生素的使用之间存在很好的相关性。研究表明，携带ARGS的微生物菌株死亡后，携带 ARGS的DNA可释放到环境中并持久存在，原因是在脱氧核糖核酸酶的保护下，防止其被降解，裸露的DNA分子最终又可以转入到其他细胞内。抗生素抗性基因的分子检出可以确定无疑地证明细菌的耐药性，阐释细菌耐药机理，更可以检查耐药因子的起源及传播扩散途径和动态，为耐药细菌，尤其是耐药病原菌的追踪监测提供了其它方法无法取代的最佳手段。利用现代分子生物学技术测定耐药基因的核酸序列还可用来检测耐药基因的变异，用来追踪某一耐药基因的系统发生和进化演化，并通过计算机分子结构建模而预测该耐药基因表达产物耐药谱的演化。目前的抗性基因检测方法主要有两种，传统的方法是利用抗性平板法筛选出抗性细菌，对其进行总量的测定，并鉴定出抗性细菌的种属，然后从菌体中提取DNA，再利用聚合酶链式反应(PCR)检测环境中的抗性基因。由于环境中许多微生物难以平板培养，主要是因为对其最适生长温度、PH、氧、营养成分等不十分清楚。因此，以传统微生物培养的方法评价抗性难免低估了微生物的种类。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种直接在水产养殖生物或环境样品中提取总DNA，再利用PCR方法分析抗性菌株的方法，即一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，步骤如下(1)细菌总DNA的提取提取水产养殖生物或水产养殖环境样品里细菌总DNA；(2)以步骤(1)所得总DNA为模板，SEQID NO:广2所示序列为引物，PCR扩增和分析 16S rDNA序列，进行测序，鉴定菌株的种属名称；(3)经过种属鉴定的菌株进一步测序鉴定，检测带有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因为耐氯霉素基因floR、耐磺胺类基因sull，和/或耐磺胺类基因sul2 (三种耐药基因均为北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司产品)。上游引物27f 有 19 个碱基=AGA GTT GAT CCT GGC TCA G(SEQ ID NO: 1)，下游引物 1492r 有 19 个碱基GGT TAC CTT GTT ACG ACT T (SEQ ID NO:2)。上述鉴定方法的步骤(2)中所述16S rDNA序列为SEQ ID NO:9^11所示任意一条序列；步骤(3)所述耐氯霉素基因floR序列如SEQ ID N0:12所示，耐磺胺类基因sull序列如SEQ ID N0:13所示。上述方法除用于鉴定外，也可以用于筛选水产养殖生物或水产养殖环境中的抗生素抗性菌株。其中，步骤(1)细菌总DNA的提取优选如下操作方法(1)将分离纯化的细菌接种于2216E液体培养基或LB液体培养基中，隔夜摇床培养；其中分离纯化优选平板划线法，2216E液体培养基(可从青岛海博生物技术有限公司购买)主要适用于海水环境，LB液体培养基主要适用于淡水环境，LB配方包括胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L ；(2)吸取经过培养的菌液，7500rpm离心5min，弃上清液；(3)沉淀加入无菌水，振荡摇勻后，沸水煮IOmin；(4)12000rpm离心lOmin，上清液即可作为DNA模板。步骤(2)鉴定细菌的PCR反应体系为50 μ L，内含2XPCR Reaction Mix 25μ , 10 μ M的引物27f和引物1492r各2μ 、2. 5U的Taq酶0. 5 μ L、含50 150ng的DNA模板溶液 2μ 、ddH20 18. 5 μ L0步骤(2)鉴定细菌的PCR扩增条件为94 °C预变性5min，然后94°C变性30s，55°C 退火30s，72°C延伸90s，共30个循环，最后在72°C充分延伸lOmin。步骤(2)鉴定细菌的PCR扩增16S rDNA产物大小为1. 5Kbp。步骤(3)中检测抗生素抗性基因的PCR反应体系为20 μ L，其中2XPCR Reaction Mix 10μ L,2. 5U 的 Taq 酶 0. 2μ 、10 μ M 的上下游引物各 0. 8 μ L、含 50 150ng 的 DNA 模板溶液 lyL，ddH207. 2 μ L0扩增耐氯霉素基因floR使用的引物序列上游引物floR-FW有18个碱基TGGCTC CTT TCG ACA TCC (SEQ ID NO: 3)，下游引物 floR-RV 有 19 个碱基:ATC CAC ATC GGT AGG ATG A (SEQ ID N0:4)。扩增耐氯霉素基因floR的条件为94 °C预变性5min，然后94°C变性45s，52°C退火30s，72°C延伸60s，共30个循环，最后在72°C充分延伸5min。扩增耐磺胺类基因sull使用的引物序列为上游引物sull-FW有22个碱基CGC ACC GGA AAC ATC GCT GCA C(SEQ ID NO: 5)，下游引物 sull-RV有 22 个碱基TGA AGT TCC GCC GCA AGG CTC G (SEQ ID NO:6)。扩增耐磺胺类基因sul2使用的引物序列上游引物SU12-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志坚，陈旭凌，何建国，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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