一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及新型快速FISH探针的制备方法，用这种方法制备了人3号染色体特异性探针进行试验，试验结果表明，新型快速FISH探针的制备方法能够准确快速地对人3号染色体进行定位，对未来染色体异常快速检测方法的探究起指示性作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
焚光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridizat1n)是一项在体外直接观察细胞中特定核酸的技术。根据碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目标序列互补结合。由于探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够在荧光显微镜下被清楚地观察到，是一种直观有效的检测方法。由于传统FISH探针序列的长度较大，导致所需要的杂交时间很长(一般是过夜杂16-18小时)，不能及时的得到检测结果，这不利于临床的诊断及治疗。对FISH探针进行改进，缩短杂交时间，提尚检测效率，有利于临床的诊断及治疗。有必要研宄出一种新型快速FISH探针的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术所采取的技术方案是: 新型人3号染色体探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，3号染色体特异性探针的序列为: 探针 1:TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA 探针 2: CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG 探针 3: CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA 探针 4: CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT 探针 5: CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG 探针 6:ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC 探针 7:ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT 探针 8: CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA 探针 9: CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC 探针 10: CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA 探针 11:AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC 探针 12: CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG 探针 13:ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT 探针 14: CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG 探针 15: CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG 探针 16: CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG 探针 17: CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG 上述检测试剂盒中的使用的探针中，3号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。优选的，上述探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。优选的，上述探针所用缓冲液为:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0?8.8)，1mMMgCl2,10% ?30% 甲酰胺。优选的，上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。本专利技术的有益效果是: 本专利技术试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16?18小时缩短至I?2小时，可以快速、准确地检测出人3号染色体，对未来染色体异常快速检测方法的探宄起指示性作用。【附图说明】图1是人3号染色体经本试剂盒荧光探针染色后的镜检结果。【具体实施方式】实施例1: 一、新型人3号染色体探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，3号染色体特异性探针的序列为:探针 1:TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA探针 2: CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG探针 3: CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA探针 4: CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT探针 5: CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG探针 6:ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC探针 7:ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT探针 8: CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA探针 9: CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC探针 10: CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA探针 11:AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC探针 12: CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG探针 13:ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT探针 14: CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG探针 15: CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG探针 16: CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG探针 17: CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG 其中，3号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。该探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。实验时，加入10ul的缓冲液溶解探针干粉，缓冲液的成分为:20mM?50mMTris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10% ?30% 甲酰胺。上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。二、FISH 检测: 1.羊水样本处理 1)取彡5ml羊水转移到15ml的离心管(标记)中，2000rpm室温离心10分钟； 2)观察并记录沉淀情况，上清(约4ml)转移到新15ml离心管(标记)，置4°C冰箱中保存； 3)沉淀加入5mlIxPBS并混匀，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ； 4)加入5ml的0.05%胰酶溶液，反复吹打混匀，37°C放置5_10分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ； 5)加入5ml0.075M KCl，反复吹打混匀，37°C孵育20分钟； 6)缓慢贴壁加入Iml的固定液，室温孵育5分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清至约 Iml ； 7)沉淀吹打混匀，缓慢加入Iml固定液，轻柔吹打混匀。再加入5ml的固定液，放入-20°C冰箱中至少I小时以上； 8)2000rpm室温离心10分钟，尽可能吸尽上清。2.滴片 1)视细胞沉淀量酌情加入固定液，吹打混匀，滴于(3ul悬液)准备好的干燥玻片上，自然晾干后于光镜下观察细胞密度，10倍镜下每一视野内细胞数不少于100个，根据镜检结果用新鲜固定液调整细胞悬液浓度，重新滴片备用； 2)室温下过夜老化或60°C热台烘烤30分钟老化备用。3.杂交前处理 1)取出玻片，放入IXPBS室温洗涤3分钟； 2)取出玻片，放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟； 3)取出玻片，放入室温IXPBS中3分钟； 4)取出玻片，放入另一缸室温IXPBS中3分钟； 5)取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各2分钟； 6)取出玻片，室温晾干。4.杂交 1)从_20°C冰箱中取出探针干粉，震荡混匀，瞬时离心；加入10ul的缓冲液，混匀后作为杂交液； 2)加10μ I的杂交液(含3号染色体)到杂交区域，迅速盖上22 X 22mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡； 3)用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘； 4)将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性85°C:10分钟，杂交42°C:20分钟。5.杂交后处理 1)将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型人3号染色体探针的制备方法及其应用，通过NCBI Mapview数据库检索并下载人3号染色体的序列，在染色体着丝粒上找到重复性高，特异性好的序列作为3号染色体的特异性探针，其中，3号染色体特异性探针的序列为：探针1：TGAGTTTGGAAACAGTCAGTTTGTA探针2：CACTTTGAGGCCATTGGTGGAAAAG探针3：CTTGTCTGTGGAATTTGCAAGGGGA探针4：CAACTCACAGAGTTTAACCTTTCTT探针5：CTCAGGAACTACTTTGTGATATGTG探针6：ATATTTGGACCTCTTTGAGGCTTTC探针7：ACAGAATCATTCTCAGGAACTACTT探针8：CTTCCTTTAGACAGTGCAGATTTGA探针9：CATAATGCTAGACAGAAGAATTCTC探针10：CTTCTTTTGGGATGTATGTATTCA探针11：AGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC探针12：CACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAG探针13：ATTCTAGCAGTATGAGGCCAATGGT探针14：CATTCTCAGAAACTGCTTTGTGATG探针15：CTCTTTGAGGCCTTCGTTGGAAACG探针16：CATAGAGCAGTTTGGAAAGACTTAG探针17：CTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTG。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华云，刘淑园，陈嘉昌，丁渭，肖湘文，黄爽，曾烨，赵丽，方凤银，
申请(专利权)人：广州和实生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44