提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法技术

一种生物技术领域的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法。包括如下步骤：①用限制性内切酶酶切ｐＣＡＭＢＩＡ２３００和ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子ｈＧＭ－ＣＳＦ基因，补平，去磷酸化，②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，③吸取适量农杆菌加入含有抗生素的ＹＥＰ培养基中，２８℃，２５０ｒｐｍ培养３６ｈｒ，④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。本发明专利技术将这两种转基因植物后代杂交，外源蛋白的表达量比亲本提高５０％以上。不改变其他的序列，仅在目的基因的末端加上的内质网和液泡导向信号，实现提高外源蛋白在植物中的积累。提高外源蛋白在转基因植物中的累积。达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的方法，特别是一种。
技术介绍
，通常是寻找高表达的启动子和调节序列。现有大量资料表明，将菜豆球蛋白C端的AFVY(Ala-Phe-Val-Tyr)液泡导向信号连在绿色荧光蛋白的末端，可以实现绿色荧光蛋白在液泡中的积累。将绿色荧光蛋白的末端加上KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)短肽，绿色荧光蛋白能在细胞质的内质网中积累。 经对现有文献检索，尚未发现在不改变启动子和调节序列的前提下，仅仅在基因末端分别加上导向内质网和贮藏液泡的运输信号，再利用传统杂交育种的途径，提高外源蛋白在植物中累积的方法，也未发现与本专利技术相同技术主题的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种提高外源蛋白在转基因植物种子中累积的方法。使其提高外源蛋白在转基因植物中的累积。构建两种含有内质网和液泡导向信号的组织特异性表达载体，分别转化植株，得到转基因后代，再将两种转基因植物后代杂交。将两种体系的优点整合到一起，从而达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。 本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括如下步骤①用限制性内切酶酶切pCAMBIA2300和pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，补平，用碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和酶切过的载体用T4连接酶连接，过夜。基因的末端有KDEL内质网导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除。 ②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是hGM-CSF基因的末端有AFVY贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除。 ③将这两种表达载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。当OD值达到0.8左右，开始用于转化拟南芥和大豆。拟南芥转化参考Clough和Bent文献(Clough S J and Bent A F，1998.Floral dipa simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16735-743)。大豆的转化采用本实验室建立的大豆转化和培养程序，其专利公开号是ZL 02150782.1(大豆转基因植株原位丛生芽再生培养方法)和ZL 0250777.5(真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化方法)。 ④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代。 ⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。 a)参考Bradford法(Bradford，1976)对总可溶性蛋白定量。取2μl蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595。 b)SDS-PAGE分离蛋白和膜上蛋白检测参照《分子克隆》(Sambrook等，1989)。蛋白在SDS-PAGE胶中电泳直到指示剂前沿达到凝胶的底部。 c)蛋白质向硝酸纤维素膜上转移在室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。 d)膜上蛋白检测加入第一抗体(抗人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；洗涤三次；在加入第二抗体(亲和素—碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟，洗涤两次；加入底物显色观察蛋白带。 本专利技术分别构建含有内质网和液泡导向信号的植物表达载体，转化植株，得到转基因后代，再将这两种转基因植物后代杂交，外源蛋白的表达量比亲本提高50％以上。本专利技术不改变其他的序列，仅在目的基因的末端加上的内质网和液泡导向信号，再将转基因株系进行杂交，利用导向信号的不同，实现提高外源蛋白在植物中的积累。提高外源蛋白在转基因植物中的累积。构建两种含有内质网和液泡导向信号的组织特异性表达载体，分别转化植株，得到转基因后代，再将两种转基因植物后代杂交。将两种体系的优点整合到一起，从而达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。 具体实施方式 以下结合具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步描述。 实施例1人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在拟南芥种子中的表达1.用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA2300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA2300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上aaggatgagctt寡核苷酸导向信号。 2.用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA2300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4 DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA2300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上gctttcgtttac寡核苷酸导向信号。 3.将含有步骤1和步骤2pCAMBIA2300表达载体的农杆菌GV3101菌液，吸取适量加入YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)/Gent(庆大霉素25mg/L)+Kan(卡那霉素50mg/L)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。22℃，5500g离心20min，去上清，用转化介质(1/2×MS大量成分(Murashigeand Skoog，1962)，1/2×B5微量成分(Gamborg et al，1968)，5％sucrose，0.05％silwet-77，44nM benzylaminopurine)重悬，调整OD值达到0.8左右。将刚开花的拟南芥倒立在转化介质中，浸30秒中，并轻轻摇动。取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，平放在干净的塑料盆中，并用薄膜覆盖闭光保湿16hr。揭开薄膜，将拟南芥放置在日光灯下，光照强度80～110μmol.m-2.s-1，并浇Hogland营养液(KNO35×10-3mol/L，KH2PO45×10-3mol/L，MgSO4.7H2O 4×10-3mol/L，Ca(NO3)24×10-3mol/L，FeSO4·7H2O 5×10-5mol/L，Na2-EDTA 5×10-5mol/L，MS微量成分(Murashige and Skoog，1962))，待其拟南芥角果完全枯黄、开裂时，收获种子。将消毒过的拟南芥种子移至含有Kan(50g/ml)的筛选平板上，均匀平铺，并吸去平板内多余的水。4’C春化2d，移至温室中，保证光照强度80～110μmol.m-2.s-1。约10d之后已转入质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴较长，并已长出两片真叶。将转化子移至已用营养液浇透的蛭石中，用薄膜保湿过夜，第二天移至气候温室中，培养条件同上。收获T2代种子，分析。 4.对这两种转基因株系后代进行杂交。 5.对后代和亲本进行蛋白定量分析。 a)取50mg叶片，加入100μl1×PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研碎；13000g，4℃离心10分钟；取上清，备用(以上过程于冰上进行)。 b本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征在于，包括如下步骤：①用限制性内切酶酶切ｐＣＡＭＢＩＡ２３００和ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子ｈＧＭ－ＣＳＦ基因，补平，去磷酸化，将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因和酶切过的载体用Ｔ４连接酶连接，过夜，基因的末端有ＫＤＥＬ内质网导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除；②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是ｈＧＭ－ＣＳＦ基因的末端有ＡＦＶＹ贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除；③将这两种表达载体分别导入农杆菌ＧＶ３１０１和ＬＢＡ４４０４中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的ＹＥＰ培养基中，２８℃，２５０ｒｐｍ培养３６ｈｒ，当ＯＤ值达到０．８左右，开始用于转化拟南芥和大豆；④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征在于，包括如下步骤①用限制性内切酶酶切pCAMBIA2300和pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF基因，补平，去磷酸化，将hGM-CSF基因和酶切过的载体用T4连接酶连接，过夜，基因的末端有KDEL内质网导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除；②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是hGM-CSF基因的末端有AFVY贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除；③将这两种表达载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP培养基中，28℃，250rpm培养36hr，当OD值达到0.8左右，开始用于转化拟南芥和大豆；④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。2.根据权利要求1所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征是，在步骤①中，所述的去磷酸化，是指用碱性磷酸酶。3.根据权利要求1所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彪，武天龙，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[]