一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术具体涉及一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法，属于免疫学和生物技术领域。本发明专利技术利用超滤和ELISA技术建立了检测人源性尿液Endocan蛋白的试剂盒，并首次证实在某些病理状态下人的尿液中存在Endocan。本发明专利技术提供的ELISA试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到人尿液Endocan蛋白含量，为基础实验和临床检验提供了一种新的手段和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学和生物
，具体设及一种人源性尿液化docan蛋白的 ELISA检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
Endocan即内皮素，又称为内皮细胞特异性分子-1(endothelialceU-specific molecule1，ESM-1)，是分子量为50KDa的可溶性蛋白多糖，由165个氨基酸的蛋白内核和 连接在137位丝氨酸残基的硫酸软皮肤素链组成。在人类其基因定位于5号染色体长臂 近端区域巧qll. 2)，具有3个外显子和2个内含子。Endocan已证实在人血管内皮细胞、 肝细胞、肾小管上皮等组织细胞中表达。其主要功能与血管新生、肿瘤细胞生长、炎症反应 相关。近来研究发现经血管内皮生长因子A(VEGF-A)刺激，Endocan可W介导内皮细胞的 迁移。体外细胞实验及小鼠体内实验均证实，Endocan过表达可W促进肿瘤细胞生长。干 扰Elndocan表达可W抑制癌细胞增殖（Overexpressionofendothelialcellspecific molecule-l巧SM-1)ingastriccancer)。研究还证实，Endocan可W与人白细胞CDlla/ CD18整合素（淋己细胞功能相关抗原-1，LFA-1)结合，抑制其与细胞粘附因子l(ICAM-l) 结合。 已有研究证实化docan参与了某些人体内常见恶性肿瘤的发生发展过程，并且 血清中化docan含量可作为某些肿瘤的诊断及预后标准物。与正常组织相比，Endocan在 肺癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌、脑胶质瘤、膀脫癌等多种癌组织中明显高表 达。已通过免疫组化证实，膀脫癌组织中化docan表达量与膀脫癌恶性程度相关。与健康 人群血清化docan含量（26. 82+10. 8化g/ml)相比，肝细胞癌患者血清中化docan含量 (87. 30+25. 69pg/ml)明显升高，并且其含量与癌症分期密切相关。Endocan诊断肝细胞 癌的特异性可达80. 8%，敏感性可达83. 8%。在早期大肠癌患者中，血清化docan含量低 的患者5年生存率为100%，而血清化docan高的患者5年生存率为80%，有显著统计学 差异。巧SM-1 regulates cell growth and metastatic process through activation of NF-kB in colorectal cancer)。研究证实，晚期胃癌患者中血清化docan含量明显高 于早期胃癌（87. 23+15. Ivs. 80. 25+15. 6pg/ml，P=0.018)，且含量高者5年生产率明显 降低（P<〇. 001)。（Overexpression of endothelial cell specific molecule-1 (ESM-1) in gastric cancer)。在膀脫癌研究中，浸润性膀脫癌患者血浆化docan含量明显（平均 0. 79ng/mL)明显高于健康对照人群（平均0. 43ng/mL)。W〇.43ng/mL作为截断值，血浆 Endocan诊断浸润性膀脫癌敏感性为64%，特异性可达80%。 此外，Endocan还参与全身炎症反应，并可作为脈毒症的诊断和预后的标志 物。研究报道脈毒症患者血清化docan含量化71 ± 4. 88ng/mL)明显高于健康人群 (0. 77 + 0. 44ng/mL)，且在脈毒症休克的患者中含量最高化11 + 12. 9化g/m)。巧ndocan，a newendothelialmarkerinhumans巧sis)。在导致多器官衰竭的严重脈毒症患者中，血 清化docan含量明显高于非多器官功能衰竭脈毒症患者（p<0. 05)，其预测脈毒症转归效果 好于降巧素原、器官序贯衰竭评分（SOFA)等传统指标。 阳0化]上述研究表明化docan在肿瘤和炎症中发挥了重要作用，其定量检测可用于相关 疾病的诊断和预后判断。W往对化docan表达的定量研究主要是采集患者和对照人群的静脉血液，用 ELISA检测血清中化docan的含量。然而，静脉采血是一种有创性操作，会导致患者疼痛、晕 针，甚至有感染及传播疾病的风险。患者依从性差。采集样品量少。不仅如此，静脉采血需 要消毒器材、静脉针、肝素化或含邸TA试剂的专用采血管等设备，更需要受过培训的专业 医护人员，成本高、用时长。而尿液，作为人体一种自然排出的体液，可W避免上述血液样品 的缺点。具有患者无痛苦，无操作相关并发症，采集不需要专业医护人员，可采集量大，方便 快捷等多种优势，是理想的人体样品来源。经查阅，目前对尿液中化docan蛋白定量检测国 内外尚属空白。 尿液蛋白需由肾脏滤过膜透过或泌尿系统细胞裂解、分泌产生，往往浓度较低。尿 液中化docan蛋白因浓度较低，采用传统的用于血液的化ISA检测试剂盒无法实现定量检 巧。。因此，建立尿液中Endocan蛋白检测试剂盒及检测方法可为其作为无创性诊断和预后 标志物的研究奠定基础。
技术实现思路
[000引专利技术人购买了市场上测血清化docan蛋白ELISA检测试剂盒，用W检测人源性尿 液Endocan蛋白，发现有W下问题：1.试剂盒适用范围不包括尿液，亦没有尿液样品的处理 方法；2.按照现有试剂盒的样品处理方法检测不出人源性尿液化docan蛋白的浓度；3.现 有试剂盒在化docan浓度在0. 3-lOng/ml范围时最准确，人源性尿液化docan蛋白多低于 此浓度。本专利技术的目的是提供一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方 法。本专利技术旨在为检测临床和实验室样品中人源性尿液化docan蛋白含量提供准确、简便、 灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。 阳010] 本专利技术采用的技术方案如下： W11] 本专利技术利用超滤和化ISA技术建立了检测人源性尿液化docan蛋白的试剂盒，并 首次证实在某些病理状态下人的尿液中存在化docan。[001引本专利技术第一方面，提供了一种人源性尿液化docan蛋白的化ISA检测试剂盒，主要 包括： 内管量程为5ml的10KD截断值的超滤离屯、管。 捕获抗体，小鼠抗人源性化docan抗体； 检测抗体，生物素标记的小鼠抗人源性化docan的抗体； 标准蛋白，为重组人化docan蛋白； 辣根过氧化物酶标记的链菌素； 所述的试剂盒，还包括有： 碳酸氨钢缓冲液、PBS缓冲液、96孔酶标板、显色液和终止液。 所述的试剂盒，96孔酶标板为市售的化ISA酶标板，较优地，可选用丹麦NUNC公司 的Maxiso巧系列化ISA酶标板（96孔，#44-2404)。[002U 捕获抗体，小鼠抗人源性化docan抗体，可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101 检测抗体，生物素标记的小鼠抗人化docan抗体，可选用法国Lunginnov公司的 LIK-1101； 重组人化docan标准蛋白可选用法国Lunginnov公司的LIK-1101; 碳酸氨钢缓冲液为0. 1M，pH= 9. 6 ; 阳0巧]PBS缓冲液为含 0. 1 %BSA，5mM邸TA，0. 1 %Tween20 的 1XPBS溶液； 显色液，四甲基联苯胺底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源性尿液Endocan蛋白的ELISA检测试剂盒，主要包括：内管量程为5ml的10KD截断值的超滤离心管；捕获抗体，小鼠抗人源性Endocan抗体；检测抗体，生物素标记的小鼠抗人源性Endocan的抗体；标准蛋白，为重组人Endocan蛋白；辣根过氧化物酶标记的链菌素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许传亮，马重，曾蜀雄，陈新，徐伟东，孙颖浩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31