本发明专利技术涉及一种可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用，重组毕赤酵母菌具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV‑G。制备方法包括（1）采用PCR反应从质粒pLP/VSV‑G中克隆VSV‑G基因片段；（2）制备重组质粒pGM‑T‑VSV‑G；（3）制备重组质粒pPIC3.5K‑VSV‑G；（4）重组表达载体通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选阳性重组子；（5）取阳性重组子进行培养诱导离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解。本发明专利技术采取的表达策略为胞内表达，有效消除了甲醇对细胞裂解液的污染。利用毕赤酵母表达系统制备VSV‑G蛋白，裂解液经过滤除菌后可直接用于细胞转染。为VSV‑G的大批量制备提供了基础，也对VSV‑G的研究及相应疾病治疗具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及合成生物学技术，基因工程技术，尤其涉及一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用。
技术介绍
水疱型口炎病毒糖蛋白G（下称VSV-G）是锚定与水疱型口炎病毒（下称VSV）表面，并含有C末端跨膜结构的三聚体病毒膜蛋白。研究发现，VSV-G在介导水疱性口炎病毒进入宿主细胞上起主要作用，且水疱性口炎病毒感染物种的普遍性也与此蛋白有关。VSV-G在较低pH值的环境中会发生构象变化，该变化导致可促进病毒体进入被感染细胞的一系列反应，包括受体细胞识别和粘附，激活受体细胞内吞以及融合受体细胞膜，病毒最终在细胞中释放病毒遗传物质，进而扩增。由于VSV感染物种的多样性和稳定性，其表面融合蛋白VSV-G已经被研究并用做假病毒体的制备，以介导向细胞内的物质传递。另外，当VSV-G被整合至人工脂质体膜上时，会形成一种类似病毒的运载体，可用于向靶细胞内运输生物大分子如抗体、DNA及一些复杂的细胞器，实验证实，该运载体的物质传递效率较高。目前，VSV-G的制备方式主要为从VSV病毒体直接提取或制备转染了VSV-G基因的细胞条件培养液。然而，一些复杂耗时的步骤，如蔗糖密度梯度离心；以及细胞培养基的高成本限制了VSV-G的大批量生产。毕赤酵母（P. pastoris）表达系统是近几年成功建立的，较为成熟可靠的蛋白质大批量生产工具。目前，很多生物活性物质已由该系统生产成功，如抗体和酶。由于转入毕赤酵母内的表达载体会以同源重组的方式整合在酵母基因组上，使得该系统具有外源基因遗传的稳定性。此外，毕赤酵母还具有成熟的蛋白修饰系统，分子操作简单易行和成本低廉等优势。此前，已有数种病毒膜蛋白在此系统中成功表达，如HIV-1表面蛋白gp120，HBsAg和登革热病毒E蛋白。由于VSV-G蛋白在基础研究和疾病治疗上具有重要意义，构建一种能够表达VSV-G的重组毕赤酵母工程菌对VSV-G的研究以及大规模制备奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术实施例所要解决的技术问题在于，提供一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用解决现有技术存在的问题。为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV-G。进一步的，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述毕赤酵母菌KM71的裂解液中。所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌中含有可表达VSV-G蛋白的基因序列，该序列如下：atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa。VSV-G基因必须编码下列氨基酸序列：Mkcllylaflfigvnckftivfphnqkgnwknvpsnyhycpsssdlnwhndligtalqvkmpkshkaiqadgwmchaskwvttcdfrwygpkyithsirsftpsveqckesieqtkqgtwlnpgfppqscgyatvtdaeavivqvtphhvlvdeytgewvdsqfingkcsnyicptvhnsttwhsdykvkglcdsnlismditffsedgelsslgkegtgfrsnyfayetggkackmqyckhwgvrlpsgvwfemadkdlfaaarfpecpegssisapsqtsvdvsliqdverildyslcqetwskiraglpispvdlsylapknpgtgpaftiingtlkyfetryirvdiaapilsrmvgmisgttterelwddwapyedveigpngvlrtssgykfplymighgmldsd本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌，其特征在于，具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV‑G。
【技术特征摘要】
1.一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，其特征在于，具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV-G。2.根据权利要求1所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，其特征在于，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述毕赤酵母菌KM71的裂解液中。3.根据权利要求2所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）采用PCR反应从质粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段；（2）回收步骤（1）所得VSV-G基因片段，并将所述VSV-G基因片段与pGM-T载体进行T-A连接，转化入大肠杆菌Top 10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pGM-T-VSV-G，以获得EcoRI酶切位点；（3）利用EcoRI对步骤（2）所得pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，连入表达载体pPIC3.5K，转化入大肠杆菌Top 10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组表达载体pPIC3.5K-VSV-G；（4）将步骤（3）所得重组表达载体pPIC3.5K-VSV-G通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选，以阳性重组子；（5）取步骤（4）所得阳性重组子接种于BMGY液体培养基培养18-24 h, 再转入...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏炽炬，王靖荃，董莹，刘鑫，李龙，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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