本发明专利技术属于生物学和药学领域，涉及筛选结核杆菌抑制剂的细胞模型及筛选方法。具体地，本发明专利技术涉及一种细胞，其表达结核杆菌的L12蛋白和L10蛋白，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域位于一个表达载体，L10的编码基因与转录因子的DNA结合结构域位于另一个表达载体。本发明专利技术还涉及式I或式II所示的化合物在制备结核杆菌L12蛋白和L10蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物中的用途。本发明专利技术的细胞模型能够有效地用于抗结核杆菌药物的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学和药学领域，涉及。
技术介绍
近年来结核病在全球范围内卷土重来，結核菌的耐药成为当前结核病治疗中所面临的最严重问题。筛选、发现和验证抗结核药物的分子靶标，从靶标上实施突破，是获得新型高效低毒抗结核药物、解决结核治疗特别是耐药结核治疗问题的关键所在。核糖体是细胞内蛋白质合成的场所，而细胞生命的维持依赖于蛋白质功能的正 常行使，因此核糖体成为药物研发的重要祀标(Huntington K M, et al. Synthesis andantibacteria丄 activityof peptide deformylase inhibitors. Biochemistry,2000，39(15) :4543-4551 ；Sinha R R，et al. Thiazoleand oxazole peptides !biosynthesis andmolecular machinery. NatProd Rep，1999，16 (2) :249-263.)。蛋白-蛋白的相互作用是生命活动中广泛而重要的相互作用，是蛋白质正常行使其功能的重要条件，因此蛋白-蛋白相互作用是药物靶标研究的另一重要方向。微生物核糖体蛋白由50S大亚基和30S小亚基组成，大亚单位含有23SrRNA，5SrRNA与30多种蛋白质，小亚单位含有16SrRNA与20多种蛋白质。这些蛋白复合并与核糖组成核糖体正常行使其功能。在微生物核糖体组成蛋白中，众多蛋白作为组成型或功能型亚基协同发挥作用。目前，已经发现多个蛋白间的相互作用机制，如通过共结晶方法证实E.coli核糖体大亚基组成蛋白L12和LlO存在相互作用(Gudkov, A. T. The L7/L12 ribosomaldomain of the ribosome !structural andfunctional studies. FEBS Lett，1997，407 :253-256.)。L12(L7/L12)(编码基因是rplL)是核糖体组成蛋白中唯一的多拷贝蛋白，其中L12是正常的，L7是N末端丝氨酸氨酰化的蛋白，二者以4 I比例的ニ聚体形式存在，简称L12。在核糖体中L12对于转录的有效性和精确性是重要的，井能够激发转录因子的GTP激酶活性。在L12的N末端有两个与LlO结合的部位，L12功能的发挥依赖LlO (编码基因是 rplj)将其锚定于大亚基(Mihaela Diacnu, et al. Structural Basis for theFunctionof the Ribosome L7/L12 Stalk in Factor Binding and GTPaseActivation.Cell，2005，121 :991-1004 ;Griaznova 0，Traut RR. Deletion of C-terminal residuesof Escherichia coli ribosomalprotein LlO causes the loss of binding of one L7/L12 dimer ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry,2000,39(14)4075-4081.) oL12和LlO在结核杆菌中与E. coli中具有高度的保守性，S. T. Cole的研究也表明结核杆菌中的L12与LlO具有相互作用(S.T.Cole，R. Brosch, J. Parkhill, etal. Deciphering the biology ofMycobacterium tuberculosis from the completegenome sequence. Nature，1998，393，537-544.)。L12 与 LlO 相互作用的正常进行是结核杆菌正常生长所必须的；而L12和LlO的编码基因在結核杆菌内具有保守性并且与人类基因具有很低的同源性，因此具备作为抗结核药物靶标的基本条件。尽管L12和LlO的相互作用已经通过共结晶方法进行验证，但是能否能在生物模型中验证结核杆菌的L12和LlO相互作用，这种相互作用能否用于新型抗结核药物筛选，仍需要进ー步的研究。
技术实现思路
本专利技术人经过创造性的劳动和大量的试验，首次利用酵母双杂交的方法(Fieldsb, Song O. A novel genetic system to detect protein—protein interaction. Nature,1989,340 :245-246 ；M Yang,Z ffu,an dFields S.Protein-peptide interactions analyzedwith he yeast two-hybrid System. Nucleic Acids Res, 1995, 23 :1152-1156.)证明了结核杆菌L12和LlO之间的相互作用。并且惊奇地发现，L12和LlO在酵母细胞中能够相互作用，使得酵母双杂交系统载体中的真核转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域在空间上也相互接近，形成完整的转录因子，从而激活宿主菌报告基因的表达。本专利技术人基于此建立了 L12和LlO相互作用阻断剂的体外高通量筛选模型(图I)，并利用此模型对4000个化合物进行筛选，成功发现了具有体外抗结核活性的阳性候选化合物。由此提供了下述专利技术本专利技术的ー个方面涉及ー种细胞，其表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域(AD)位于ー个表达载体，LlO的编码基因与转录因子的DNA结合结构域(BD)位于另ー个表达载体。所述的两个表达载体是不同的。具体地，所述载体可以是pGBKT7、pGADT7等。根据本专利技术任一项所述的细胞，其为酵母细胞。根据本专利技术任一项所述的细胞，其中，所述转录因子为GAL4。根据本专利技术任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。MAKLSTDELLDAFKEMTLLELSDFVKKFEETFEVTAAAPVAVAAAGAAPAGAAVEAAEEQSEFDVILEAAGDKKIGVIKVVREIVSGLGLKEAKDLVDGAPKPLLEKVAKEAADEAKAKLEAAGATVTVK(SEQ ID NO 1)MARADKATAVADIAAQFKESTATLITEYRGLTVANLAELRRSLTGSATYAVAKNTLIKRAASEAGIEGLDELFVGPTAIAFVTGEPVDAAKAIKTFAKEHKALVIKGGYMDGHPLTVAEVERIADLESREVLLAKLAGAMKGNLAKAAGLFNAPASQLARLAAALQEKKACPGPDSAE(SEQ ID NO 2)根据本专利技术任一项所述的细胞，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列序列如SEQ ID NO :3(rplL，GeneID :888078)所示，LlO蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(rplJ, GeneID :888049)所示。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种细胞，其表达结核杆菌核糖体蛋白L12和L10，其中，L12的编码基因与转录因子的转录激活结构域位于ー个表达载体，LlO的编码基因与转录因子的DNA结合结构域位于另ー个表达载体。2.根据权利要求I所述的细胞，其满足如下的(1)-(3)中的一项或者多项 (1)所述细胞为酵母细胞； (2)所述转录因子为GAL4； (3)L12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，LlO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求I所述的细胞，其中，L12蛋白的编码基因的核苷酸序列序列如SEQIDNO 3所示，LlO蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。4.根据权利要求I所述的细胞，其中，所述细胞能够在缺陷性培养基SD/-Trp-Leu_Hi s-Ade 上生长。5.一种用于筛选结核杆菌L12蛋白和LlO蛋白相互作用阻断剂、抗结核杆菌药物、或者治疗和/或预防结核病的药物的细胞模型，其包含权利要求1-4中任一项所述的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞模型，其还包含空白对照细胞和/或阴性对照细胞；优选地，所述空白对照细胞为不转染有任何载体的空白酵母细胞，所述阴性对照细胞为染有两个不同的表达载体的酵母细胞，两个表达载体中各插入有不同的基因，该两个不同的基因表达的蛋白能够相互結合，并且表达的蛋白不是L12和...
【专利技术属性】
技术研发人员：司书毅，林媛，李妍，王彦昶，蒋建东，肖春玲，洪斌，高娜娜，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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