NIK抑制剂基于细胞的筛选测定制造技术

本发明专利技术涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。根据本发明专利技术的方法允许鉴定抑制与IKK1磷酸化有关的NIK活性的化合物。该测定组合使用经转染的人胚肾（HEK）细胞与使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。根据本专利技术的方法允许鉴定抑制与IKK1磷酸化有关的NIK活性的化合物。该测定组合使用经转染的人胚肾（HEK）细胞与使用“受体”珠和“供体”珠的非放射性、均相接近测定。【专利说明】NIK抑制剂基于细胞的筛选测定专利
本专利技术涉及用于筛选和鉴定NIK蛋白质抑制剂的基于细胞的测定。_2] 专利技术背景 转录因子的核因子κΒ (NF-KB)家族包含结构上相关蛋白质的集合，所述蛋白质参与多种生物学过程，包括免疫应答、炎症、细胞死亡和存活(Thu Y.M.和Richmond A.Cytokine & Growth Factor Rev 2010, 21:213-226)。哺乳动物NF-K B家族包含五个成员，包括p65 (也已知为RelA)、p50 (也已知为NF-κ BI), P52 (也已知为NF-kB2)、RelB和c-Rel，其通过与κ B增强子结合形成能够调节多种下游基因靶的转录和表达的几种二聚复合物。典型形式的NF-κ B由ρ50/ρ65异二聚体组成。只要此类复合物与K B蛋白质的抑制剂(I K BS)的成员特别是I K Ba结合，它通常就以失活形式在细胞质中隔离(Sun S.C., Cell Res 2011，21:71-85)。目前已知控制NF-K B活化的两个主要途径即经典和非经典途径。众所周知的经典NF-κ B途径通过广泛范围的细胞外刺激触发，所述细胞外刺激包括促炎细胞因子例如TNFa、IL-1 β、IL-6和⑶40L。这个途径一般通过κ B激酶三聚复合物激酶(IKK a、-β和-Y)的抑制剂介导,所述K B激酶三聚复合物激酶使I K B成员磷酸化，依次又导致I K BS通过蛋白酶体的遍在蛋白化和完全降解，并且允许释放的RelA/p50异二聚体易位到细胞核内，以起始基因转录(Hayden M.S.等人，Cfe77 2008, 132:344-362 ；VallabhapurapuS.等尺,Annu Rev Immunol 2009, 27:693-733)。除了众所周知的经典途径外，还存在非经典途径。这个可选NF-κ B活化途径通过一组肿瘤坏死因子配体(TNFL)家族成员诱导，所述家族成员例如⑶40配体(⑶40L)、B细胞活化因子(BAFF)或淋巴毒素β受体(LTiiR)的配体。实验证据暗示这个途径在调节许多生物学过程中是重要的，所述生物学过程例如次级淋巴器官发育、B细胞存活和成熟以及涉及适应性免疫的特异性趋化因子的诱导(Dejardin E., Biochem Pharmacol 2006,72:1161-1179)。这个途径涉及通过诱导plOO前体蛋白质经由IKKa和NF-κ B诱导激酶(NIK)蛋白质加工为成熟P52的RelB/p52复合物活化。两种激酶都使plOO磷酸化，所述plOO含有I K B样C末端部分且因此充当NF-K B抑制剂，导致plOO蛋白质的部分蛋白酶解，以获得活性形式p52。plOO的加工因此作用于生成p52且诱导RelB/p52异二聚体的核易位(CoopeH.J.等人，万遍0 / 2002，15:5375-5385)。使用显性失活突变体的过表达，将NIK首先鉴定为介导TNFa和IL-1受体下游的近端信号传递的激酶，并且NIK的激酶活性是这个过程所必需的(Malinin N.L.等人，Nature 1997，385:540-544)。NIK 还通过其他受体例如 CD27、CD30、CD40、LT β R 和 BAFFR介导刺激。当过表达时，NIK导致NF- K B的活化，因此保护细胞不经历TNF α诱导的细胞凋亡。NIK已证实与IKKa和ΙΚΚβ相互作用且活化IKK a和ΙΚΚβ。然而,NIK使IKK a磷酸化至比ΙΚΚβ更大的程度。因此，NIK充当负责多种细胞因子受体的近端信号传递的上游IKK复合物激酶。IKKa (也已知为IKK1)是NIK的优先底物。NIK直接使IKK a在Ser-176上磷酸化，并且这个残基突变为丙氨酸阻止IKK a的NIK活化，因此破坏来自IL-1和TNF a刺激的信号(Ling L.等k，Proc Natl Acad Sci 1998，95:3792-3797)。从与IKKa的优先相互作用可以推断NIK是对于IKKa比对于ΙΚΚβ更重要的激酶，并且NIK仅是非经典途径所必需的。然而，取决于诱导物和细胞类型，NIK的确在经典和非经典NF- K B途径中都起作用。来自使用具有NIK敲除或具有天然存在的NIK缺损突变体、淋巴发育不全(aly/aly)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的研究的数据支持这个观点(Shinkura R.等人，Tfeiare Genetics 1999, 22:74-77)。NIK是PlOO至p52的加工所必需的，因此证实其在非经典途径中的作用(XiaoG.等)κ，Mol Cell 2001, 7:401-409)。NIK或IKK α的激酶活性不是plOO对两种激酶募集所必需的，然而，它是发生配体诱导的蛋白酶解所必需的(Xiao G.等)\，J Biol Chem2004，279:30099-30105)。令人惊讶的是，NIK不是plOO至p52的组成性加工所必需的。NIK控制plOO至p52加工的机制是通过其稳定性。在用配体例如⑶40L或BAFF刺激后，使基础翻译的NIK稳定，以诱导plOO至p52加工(Qing G.等人，J Biol Chem 2005，280(49): 40578-82)。总之，NIK是在经典途径中起作用的激酶，但仅是响应特定配体的NF- K B活化所必需的。这个选择性需求的生理学意义仍然是难以捉摸的。可能，NIK位于NF-K B的经典和非经典途径的十字路口，维持这两个途径之间的正和负调节平衡。例如，NIK活化经典途径，并且因此可能诱导PlOO (NF-kB家族的第四个I K B)的产生(负反馈机制)。同时，NIK是负责加工这种I K B的激酶，从而使得它将释放NF- K B异二聚体例如RelA/p50，以活化基因转录(正反馈机制)。因此已变得非常明确的是NIK在NF- K B活化中起动态作用，协调NF-κ B的经典和非经典调节之间的复杂平衡。由于NIK在调节与许多疾病相关的并特别是在炎性/自身免疫疾病中的生物学过程中可以具有的重要作用，已报道了一系列对于NIK的生物化学和基于细胞的测定。Ling L.等人GdToc Natl AcacI Sci 1998，95:3792-3797)公开了 用编码FLAG-NIK-wt和FLAG-1KK- α (激酶失效)的表达质粒瞬时转染的HEK细胞的使用。在36小时转染后，使免疫纯化的蛋白质与Y - -ATP温育，通过SDS-PAGE分辨，并且通过放射自显影术分析。这些研究显示发生FLAG-1KK- α (激酶失效)的FLAG_NIK_wt特异性磷酸化。使用 FLAG-1KK- a (kd) -S176A、FLAG-1KK- a (kd) -T179A 和 FLAG-1KK- a (kd) -S180A作为底物执行进一步实验，并且这些显示主要NIK介导的磷酸化位点是本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定抑制NIK活性的化合物的方法，其包括：（a）提供在培养基中含有编码NIK的DNA和编码IKK1?KD的DNA的HEK细胞（经转染的HEK细胞）；（b）在37℃?+/??2℃的温度下在5%?CO2的存在下，使所述经转染的HEK细胞连同和不连同待测试的候选分子温育24小时；（c）去除所述培养基；（d）裂解所述细胞；（e）将受体复合物随后将供体复合物加入所述细胞裂解产物中；（f）用激光照射激发所述细胞裂解产物，和（g）使用基于珠的发光接近检测系统，测量细胞裂解产物被激光激发后产生的信号，其中得自细胞裂解产物的信号的减少或不存在指示NIK介导的IKK1?KD磷酸化的抑制，所述细胞裂解产物来源于在测试化合物的存在下培养的经转染的HEK细胞，并且其中所述受体复合物包含分子包被的珠和与所述IKK1?KD蛋白质结合的结合配偶体，并且所述供体复合物包含分子包被的珠和与所述IKK1?KD蛋白质结合的结合配偶体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R霍夫特范休斯杜伊南，S格尔，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：
国别省市：