一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，涉及一种纺锤体检验点抑制物。以Hela细胞为模型，根据纺锤体检验点在细胞分裂中的作用机制，利用有丝分裂细胞与间期细胞有着不同粘着力的特性，利用MTT的实验原理，借助一个已知的阳性纺锤体检验点抑制物(12W)验证这个筛选方法的可靠性，建立一个灵敏、易于操作、低成本的可用于高通量筛选纺锤体检验点抑制物的方法。有助于开发具有疗效显著且毒副作用低的纺锤体检验点抑制物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种纺锤体检验点抑制物，尤其是涉及。
技术介绍
在真核生物中，纺锤体检验点(The spindle checkpoint)是保证细胞分裂过程中染色体正确分离的重要监控机制之一。细胞纺锤体检验点功能被削弱是肿瘤细胞的一个重要特征。然而现有研究表明，完全抑制细胞的纺锤体检验点却可以诱导细胞死亡。由于正常细胞与肿瘤细胞在纺锤体检验点功能上的差异使得纺锤体检验点成为目前抗肿瘤药物研发的靴点之一。国外有实验室(DeMoe JH,Santaguida S,Daum JR,Musacchio A,Gorbsky GJ :A high throughput, whole cell screen for small molecule inhibitors of the mitotic spindle checkpoint identifies 0M137, a novel Aurora kinase inhibitor. Cancer Res 2009 ；69 :1509-1516 ； Stolz A, Vogel C, Schneider V,Ertych N, Kienitz A, Yu H, et al !Pharmacologic abrogation of the mitotic spindle checkpoint by an indolocarbazoIe discovered by cellular screening efficiently kills cancer cells. Cancer Res 2009 ；69 :3874-3883)建立了高通量的纺锤体检验点抑制物的筛选方法并正在进行相关化合物的筛选，但这些筛选方法存在着操作步骤繁琐、成本高及需要借助特殊仪器设备等缺点，限制了这些筛选方法的广泛应用，国内目前还未见有关建立纺锤体检验点抑制物筛选方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可供高通量的筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法。本专利技术包括以下步骤1)将Hela细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；在步骤1)中，所述培养液可采用DMEM细胞培养液，所述培养可在37°C，5% CO2的条件下培养。2)当细胞密度达到80% 90%时，加入诺考达唑(Nocodazole)处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板或384孔板上；在步骤2)中，所述处理的时间可为12 16h，所述加入诺考达唑的终浓度可为 50 200ng/ml ；所述96孔板或384孔板上的细胞密度为10，000 20，000个/孔。3)随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；在步骤幻中，所述加入待测化合物的量，按体积比，培养液待测化合物为 1000 1 ；可根据化合物文库及实验目的自己设计化合物终浓度(根据具体药物种类选择具体浓度)，所述细胞培养液可为等量的DMEM细胞培养液，所述培养可在37°C下细胞培养箱中培养4 他。4)洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；4在步骤4)中，所述洗去未贴壁细胞可用PBS洗去未贴壁细胞，最好重复2 3次； 所述细胞培养液可采用含 0. 5mg/ml MTT ((3- (4，5-cimethylthiazol_2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium Bromide ；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝) 的细胞培养液；所述细胞培养液的加入量可为待测化合物的10 20倍，所述反应的温度可为37°C，反应的时间可为2 4h。5)去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜(DMS0)，溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再检测0D570读值；在步骤幻中，所述加入二甲基亚砜的量可为每孔加入100μ 1 ；所述检测可采用酶标仪检测。6)当待测化合物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值大于2时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；7)进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10 20uM的MG132 ；8)加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的DMEM细胞培养液培养；在步骤8)中，所述加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物的量可与步骤幻所加入的待测化合物的量相同；所述培养，可在37°C下细胞培养箱中培养4 6h。9)重复上述步骤4)和5)；10)潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值在0. 6 12之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。本专利技术以Hela细胞为模型，根据纺锤体检验点在细胞分裂中的作用机制，并利用有丝分裂细胞与间期细胞有着不同粘着力的特性，充分利用MTT的实验原理，并借助一个已知的阳性纺锤体检验点抑制物(12W)验证这个筛选方法的可靠性，从而建立了一个灵敏、易于操作、低成本的可用于高通量筛选纺锤体检验点抑制物的方法。在本专利技术中，利用细胞处在细胞周期不同时期(有丝分裂期和间期)时细胞形态及与培养皿底部贴附能力的差异。很多体外培养的细胞在有丝分裂间期时牢固贴附在培养板上，而在有丝分裂期时形态变圆，使其与培养皿的贴附能力变弱，容易从培养皿上脱落。当完成有丝分裂后，细胞又将变得扁平并重新贴壁。一些微管药物如Nocodazole (诺考达唑)可以通过激活纺锤体检验点而将细胞阻滞在有丝分裂期，当轻轻摇晃培养皿时可以很容易地将这些细胞移去；而当这些细胞的纺锤体检验点被抑制后，它们将退出有丝分裂，重新变成扁平状并贴附在培养皿上。在本专利技术的模型中，首先将由于Nocodazole作用而处于有丝分裂期的细胞转移到 96孔板或384孔板上，随后测试一系列化合物诱导这些被阻滞在有丝分裂期的细胞退出该有丝分裂期的能力。阳性化合物能诱导细胞退出有丝分裂，细胞将重新牢固贴附在培养板上，而在阴性化合物作用的孔中，细胞仍处于有丝分裂期并且与培养板的贴附能力很弱，这些细胞在随后的洗涤过程中将被洗去。在去除未退出有丝分裂的细胞之后，留在每孔中的细胞数与化合物对纺锤体检验点的抑制活性呈正相关。这时我们利用MTT实验的原理，通过细胞活性与细胞数的相互关系来揭示留在96孔板上每孔所含细胞的相对数量。MTT实验具灵敏度强、方便操作、重复性高等优点，将MTT实验的原理运用于纺锤体检验点抑制物筛选方法，是本专利技术筛选模型的一大创新点。为了提高筛选方法的可靠性，尽可能排除假阳性化合物，在第一步筛选的基础上，本专利技术设计了第二步筛选。因为纺锤体检验点抑制物是通过激活APC/C(Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome)的泛素连接酶活性、以蛋白酶体-泛素化途径降解一些关键的有丝分裂相关蛋白从而诱导细胞退出有丝分裂，所以蛋白酶体活性对于纺锤体检验点抑制物发挥作用是至关重要的。基于这一理论，在第二步筛选中，将蛋白酶体抑制物MG132与第一步筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物一起作用于阻滞在有丝分裂期的细胞，在有MG132的情况下，纺锤体检验点抑制物将不能诱导细胞退出有丝分裂期，而大多数假阳性化合物是通过抑制CDK激酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：１）将Ｈｅｌａ细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；２）当细胞密度达到８０％～９０％时，加入诺考达唑处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到９６孔板或３８４孔板上；３）随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；４）洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；５）去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜，溶解步骤４）中形成的甲瓒结晶，再检测ＯＤ５７０读值；６）当待测化合物所对应孔的ＯＤ５７０与阴性对照孔的ＯＤ５７０之间比值大于２时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；７）进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤１）和２），并在原步骤２）中多加入终浓度为１０～２０ｕＭ的ＭＧ１３２；８）加入从步骤６）中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的ＤＭＥＭ细胞培养液培养；９）重复上述步骤４）和５）；１０）潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的ＯＤ５７０与阴性对照孔的ＯＤ５７０之间比值在０．６～１．２之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓彤，吴振华，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92
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