一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，通过检测家兔SANFH模型的股骨头组织中骨细胞的凋亡指数及MAP1-LC3的表达，表明自噬基因Beclin1即可调节自噬活性，又可以选择性的与Bcl-2家族成员相结合而调节细胞凋亡的活性。本发明专利技术通过检测Beclin1在SANFH模型中的表达，为治疗SANFH提供新的分子靶标。本发明专利技术方法简单，操作方便，较好的解决了国内外并未见到关于SANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的问题，填补了ANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的空白。

【技术实现步骤摘要】
—种Becl in1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法
本专利技术属于股骨头缺血坏死研究
，尤其涉及一种Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法。
技术介绍
激素性股骨头缺血坏死(Steroid-1nducedavascular necrosis of femoralhead,SANFH)是指因长期或短期大量使用肾上腺皮质激素(以下简称激素)后造成股骨头活性成分的死亡所引起的病理过程。SANHl占非创伤性股骨头缺血坏死病因的首位。由于临床中激素的广泛应用，使得SANFH发病率逐年增高。目前关于SANFH的发病机制已经有多种假说，包括:骨内压增高、骨的灌注下降、脂肪栓塞、高凝状态等，造成股骨头的血流量减少，从而导致股骨头缺血坏死。但是以上学说均未能够完全阐明SANFH的发病机制，因此尽快探明SANFH的发病机制显得更加重要。近年来国内外学者把焦点集中于I型程序性细胞死亡-细胞凋亡(apoptosis)在SANFH中的作用的研究。因为在SANFH中观察到大量的骨细胞凋亡，所以有学者推断在SANFH的最后阶段，股骨头的血管功能发生障碍，最终导致骨细胞发生凋亡，甚至有学者直接将细胞凋亡归因于SANHl的发病机制。Robert S等分别对5例激素性、3例酒精性及I例创伤性股骨头缺血坏死患者的股骨头进行研究，观察到SANFH患者股骨头切片中存在大量凋亡的骨细胞，酒精性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡相对较少，而创伤性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡是罕见的，这一研究支持细胞凋亡在激素性和酒精性股骨头缺血坏死发病机制中起重要作用的观点。自噬现象最早是Ashford和Porten于1962年在肝细胞中观察到的，他们将高血糖素加入鼠的肝灌流液中，结果在电镜下发现肝细胞的溶酶体增多并发生自食(self-eating)现象，De Duve将该现象命名为“autophagy (自卩遼)”。长期以来，自卩遼只被认为是细胞降解胞内物质的一种正常生理过程，因此，并未引起广泛关注。直到近10多年来，在酵母中首先发现了自噬的分子机制，随后在哺乳动物细胞中也发现了相似的机制，使得自噬的研究取得了重大进展，并成为近几年分子生物学领域中的研究热点。自噬是机体选择性降解细胞内成分的基本过程，当细胞遭受应激时，自噬可维持细胞的存活，但是当这种应激超过一定水平时，自噬还可导致非凋亡形式的自噬性程序性细胞死亡，因其有别于凋亡而被称为II型程序性细胞死亡。自噬作为一个强大的代谢平衡推动者，可以预防退化性疾病的发生。然而自噬也有不利的一面，在营养缺乏的肿瘤中，瘤细胞正是利用自噬才得以存活的。Levine等研究表明自噬通路和自噬蛋白在免疫和炎症中也起到决定性作用，它们可能通过平衡免疫和炎症对机体的利与弊，预防和对抗传染性、自身免疫性和感染性疾病。已有研究表明激素既可以诱导骨细胞发生凋亡又可以诱导骨细胞发生自噬，但只是局限于激素导致的骨质疏松模型中以及经激素刺激体外培养的骨细胞中。国内外并未见到关于SANHl模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的报道。微管相关蛋白I轻链3 (microtubule-associated protein I light chain3,MAPl_LC3)作为自曬的标志性分子，已经被广泛应用于自噬活性的检测，
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，旨在解决国内外并未见到关于SANHl模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法,该Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤:步骤一，选择成年日本大耳白兔40只，体重(2.32±0.14) kg，随机分为实验组与对照组，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg/kg，2次/周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml /只，2次/周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4%多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；步骤二，将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10% EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波温度为40°C?60°C间歇脱钙，每次辐射I分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为I分钟X 20次/ 24小时X7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；步骤三，左侧股骨头经4%多聚甲醛溶液固定24h后，在10% EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5 μ m切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数；步骤四，采用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’-0H(3-羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’-0H末端，检测凋亡细胞，采用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数/ 50)；步骤五，免疫组化方法检测股骨头Beclinl及MAP1-LC3的表达，采用SABC法，然后用苏木素复染lmin，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察；步骤六，Western blot检测股骨头骨组织中Beclinl和MAP1-LC3蛋白的表达水平；步骤七，统计学方法，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以(7±S)表示，计数资料采用X 2检验，组间比较独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。进一步，在步骤五中，SABC法的具体步骤为:先将组织切片在烤箱中60°C放置60min，30 % H2O2I份+蒸馏水10份混合，室温5-10min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.0lM枸橼酸盐缓冲液中(pH6.0),微波炉加热至沸腾后停止，间隔5min?IOmin后，反复I次?2次,冷却后用PBS (pH7.2-7.6)洗涤I次?2次，滴加5% BSA封闭液，室温中放置20min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1: 500的兔抗兔Beclinl多克隆抗体和稀释度为1: 500兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，20°C放置2h，PBS(pH7.2-7.6)洗涤2minX 3次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37°C放置20min, PBS(pH7.2-7.6)洗涤5minX4次;使用DAB显本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Beclin1和MAP1?LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，该Beclin1和MAP1?LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤：步骤一，选择成年日本大耳白兔40只，体重(2.32±0.14)kg，随机分为实验组与对照组，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg／kg，2次／周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml／只，2次／周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4％多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；步骤二，将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10％EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波温度为40℃～60℃间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次／24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；步骤三，左侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，在10％EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5μm切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数；步骤四，采用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’?OH(3?羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’?OH末端，检测凋亡细胞，采用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆 内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数／50)；步骤五，免疫组化方法检测股骨头Beclin1及MAP1?LC3的表达，采用SABC法，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察；步骤六，Western?blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1?LC3蛋白的表达水平；步骤七，统计学方法，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以表示，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。FSA0000098627210000021.tif...

【技术特征摘要】
1.一种Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，该Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤: 步骤一，选择成年日本大耳白兔40只，体重(2.32±0.14)kg，随机分为实验组与对照组，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg / kg，2次/周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml /只，2次/周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4%多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存； 步骤二，将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10% EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波温度为40°C~60°C间歇脱钙，每次辐射I分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为I分钟X20次/ 24小时X7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准； 步骤三，左侧股骨头经4%多聚甲醛溶液固定24h后，在10% EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5 μ m切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数； 步骤四，采用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’-OH(3-羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端，检测凋亡细胞，采用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数/ 50)； 步骤五，免疫组化方法检测股骨头Beclinl及MAP1-LC3的表达，采用SABC法，然后用苏木素复染lmin，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察； 步骤六，Western blot检测股骨头骨组织中Beclinl和MAP1-LC3蛋白的表达水平； 步骤七，统计学方法，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以(Izts)表示，计数资料采用X 2检验，组间比较独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。2.如权利要求1所述的Beclinl和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，在步骤五中，SABC法的具体步骤为: 先将组织切片在烤箱中60°C放置60min，30 % H2O21份+蒸馏水IO份混合，室温5-10min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液中(pH6.0),微波炉加热至沸腾后停止，间隔5min~IOmin后，反复I次~2次,冷却后用PBS (pH7.2-7.6)洗涤I次~2次，滴加5% BSA封闭液，室温中放置20min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1: 500的兔抗兔Beclinl多克隆抗体和稀释度为1: 500兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，20°C放置2h，PBS(pH7.2-7.6)洗涤2minX 3次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37°C放置20min, PBS(pH7.2-7.6)洗涤5minX4次;使用DAB显色试剂盒，取Iml蒸馏水，加试剂盒中A，B, C试剂各一滴，混匀后滴加到组织切片上，室温下显色，镜下反应时间为lOmin，蒸馏水充分洗涤以终止反应，然后用苏木素复染lmin，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘万林，白锐，赵振群，王文选，王勇，
申请(专利权)人：刘万林，
类型：发明
国别省市：