使用免疫学技术进行的体外测定方法技术

本发明专利技术涉及体外测定培养细胞合成的胞外基质的分子的新方法及所述新方法的用途，用于体外测量的试剂盒和/或用于筛选化妆品和/或药物成分的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及体外测定培养细胞合成的胞外基质的分子的新方法及所述新方法的用途，用于体外测量的试剂盒和/或用于筛选化妆品和/或药物成分的方法。【专利说明】本专利技术涉及体外测定培养细胞合成的胞外基质分子的新方法及所述新方法的用途，用于体外测量的试剂盒和/或用于筛选化妆品和/或药物成分的方法。胞外基质(ECM)尤其是通过其支持、黏附和调节细胞交换的功能在人和动物的机体组织的结构中发挥重要作用。ECM主要由糖蛋白、蛋白质和糖胺聚糖组成。这些分子在与ECM接触的细胞中以天然形式合成。它们从胞内区室排出细胞外。在经历成熟现象后，它们变得有组织，并排列为形成ECM的网络。然后它们处于有功能的形式。尤其在化妆品和药物领域，ECM分子是研究的课题，其中许多成分旨在刺激ECM分子的合成，从而改善所讨论的组织的一般状态。在体外，培养细胞在适宜的条件中产生它们的胞外基质，并构成用于研究，尤其是用于测量细胞合成构成ECM的一种或多种分子的活性，以及成分对所述活性的影响的特别简单的模型。在这类培养细胞模型中，ECM分子任选地以多种形式，尤其是以前体形式存在于不同的培养区室(胞内区室、培养基区室)中或包含在ECM区室中。经典的测量技术包括测量培养基中的ECM分子的量。因此，根据最常用的技术，将ELISA技术用于测定培养基中的ECM分子，如胶原，任选地所述ECM分子的前体形式，如前胶原。另一种更昂贵、更具限制性和更广泛应用的技术包括:在培养基中含有细胞合成ECM分子所使用的放射性标记分子，整体测量所有区室中这样获得的放射性的强度。例如，将氚标记的脯氨酸用于测量培养细胞产生的胶原的总量。这些技术能够显示培养细胞的合成活性，但不显示这样合成的分子的功能性，即ECM中的分子的量。只有免疫组织化学分析使得有可能测定，且只是部分测定这样合成的ECM分子的功能性。此技术包括:去除培养基，用针对所研究的ECM分子的抗体标记，然后读出和/或显示荧光。此技术使得有可能定量包含在胞内区室、胞外区室及ECM中的分子，尤其显示所述分子的定位。但是，此技术难以实施，且需要昂贵的设备。此外，该技术本身不允许分析大量成分。此外，它具有主观性，且依赖于实验者。因此，在本专利技术之前，没有允许以足够快速、可靠、简单和可预测的方式测定功能分子(即确实掺入到ECM中的分子，尤其是构成ECM分子)的量的客观的定量测量法。此外，没有允许筛选具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法。然而，在胞内区室中和/或在胞外区室中测量到了培养细胞高水平合成ECM分子并非必然导致较大量的功能分子，即ECM中的分子。实际上， 申请人:能够显示，某些化妆品活性成分可以提供合成ECM的胶原的总体刺激，但未观察到胶原功能性的改善，即ECM中胶原的含量未增加。 申请人:还发现，某些成分改善胶原功能性，即胶原在ECM中的含量，但未测量到前胶原的合成的增加(实施例6和7)。因此，现有技术不适合定量ECM分子的功能性，即其在ECM中的含量，因为现有技术不是直接的，且不够可靠、可预测、可再现、可重复和特异。此外，现有技术不允许筛选化妆品和/或药物成分，其有可能以令人满意的方式改善ECM分子的功能性或使得有可能显示其在ECM中的作用。出版物Diqu6lou A.等，1995，Relationship between endothelial tissuefactor and thrombogenesis under blood conditions, Thrombosis and haemostasis, 74卷，第 2期，778-783页及Ryan J等，1992，Tumor necrosis factor-1nduced endothelialtissue factor is associated with subendothelial matrix vesicles but is notexpressed on the apical surface, Blood, 80 卷，第 4 期，966-974 页描述了在培养 4 或8小时后测定HUVECS合成的TF。然而，这类培养时间太短而不允许培养细胞合成ECM及研究构成ECM和/或包含在ECM中的分子的功能性。这些实验实际上具有其他目的。因此，存在对用于测定培养细胞合成的ECM分子的技术的需求，通过该技术可以以可靠、简单、可重复、可预测和特异的方式直接和定量地测定ECM分子的功能性，即所述ECM分子在ECM中的含量。此外，需要这样的技术，该技术不会降解ECM，使得有可能显示和定量所研究的ECM中的分子，尤其原位研究以功能形式存在的所述ECM中的分子，并研究所述ECM中的分子与ECM的其他分子的相互作用。 申请人:最近惊奇和意外地发现，可以通过进行裂解培养细胞和在ECM上直接测定目的分子的特定步骤来解决此问题。因此，根据本专利技术的方法提供现有技术的问题的技术解决方案，且具有快速、适用于小型化和允许有利地以自动化的形式筛选大量成分的优势，所述成分能增加或降低ECM中分子的量。根据本专利技术的方法还具有不破坏ECM及使得有可能定量和显示ECM分子的优势。本专利技术涉及使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤:a)培养细胞且优选地铺满培养细胞至少24小时的步骤；b)收集培养基的优选步骤；c)用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在IOOliM至2M的范围内；d)收集细胞裂解物的步骤；e)通过免疫学技术测定所述胞外基质中的分子的步骤。本专利技术还涉及使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤:a)培养细胞且优选地铺满培养细胞至少24小时的步骤；b)收集培养基并测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；c)用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在100 μ M至2Μ的范围内；d)收集细胞裂解物并测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；e)通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。本专利技术还涉及根据本专利技术的测定方法的用途，用于筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质。本专利技术还涉及筛选和/或体外研究至少一种具有化妆品益处和/或药物益处的成分的方法，所述具有化妆品益处和/或药物益处的成分具有增加和/或降低胞外基质中分子的量的性质，所述方法至少包括以下步骤:a)在所述成分的存在下培养细胞且优选地在所述成分的存在下铺满培养细胞至少24小时；b)优选地收集培养基并更优选地测定所述这样收集的培养基中ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；c)用季胺溶液裂解细胞的步骤，所述季胺溶液的浓度优选地在100 μ M至2Μ的范围内；d)收集细胞裂解物并优选测定DNA和/或测定ECM分子和/或ECM分子的前体的步骤；e)通过免疫学技术测定所述包含在胞外基质中的ECM分子的步骤。本专利技术还涉及用于根据本专利技术的方法之一的测定方法的试剂盒，所述测定方法通过免疫学方法进行，所述试剂盒优选以100 μ M至2Μ的范围内的浓度包含至少一种季胺溶液和任选本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用免疫学技术体外测定培养细胞合成的至少一种胞外基质分子的测定方法，其至少包括以下步骤：a）培养所述细胞且优选铺满培养所述细胞至少24小时的步骤；b）收集培养基的优选步骤；c）用季胺溶液裂解所述细胞的步骤；d）收集细胞裂解物的步骤；e）通过免疫学技术测定所述胞外基质中所述分子的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·博内，D·里瓦尔，
申请(专利权)人：巴斯夫美容护理法国公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR