一株微生物菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株微生物菌株及其应用，具体涉及一种烟草烟碱降解菌微杆菌GYC29(Microbacterium?sp.GYC29)CCTCC?NO：M2010311及其在烟草中的应用。本发明专利技术所公开的菌株在生长过程中可以分解利用烟碱。将该菌株的发酵液或菌体按照烟叶重量的1～5％，加入到含水量为10～50％的烟草中，发酵6～72小时可以使烟叶的烟碱含量降低2～33％，烟叶刺激性明显减少，杂气减少，烟气变醇和，感官质量明显改善。本发明专利技术通过使用微生物来实现降解烟草烟碱，可以适当调整烟叶原料的烟碱含量大小，提高烟叶的可用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株微生物菌株及其应用，具体涉及ー种烟草烟碱降解菌一微杆菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29) CCTCC NO M2010311 及其在烟草中的应用，属于微生物应用

技术介绍
烟碱又名尼古丁(Nicotine)，是烟草生物碱中的主要成分。烤烟中烟碱的含量一般在I. 5% 3. 5%,以2. 5%左右为宜。烟碱含量过低，劲头太小，烟碱含量过高，劲头太大，会引起刺呛辛辣感。降低烟草中的烟碱含量，目前主要有三条途径(I)从农业种植的角度进行调控主要从遗传、生态和栽培等方面来进行控制。(2)从化学的角度烟叶中的生物碱可通过用热水漂洗、有机溶剂萃取、气体抽提和蒸汽蒸馏等处理烟叶的方法将烟叶中的烟碱脱棹。(3)从微生物和酶的角度从烟叶、烟籽和土壌中分离能够降解烟碱的微生 物，培养后直接或者分离出酶系后作用于烟叶，降低烟叶中的烟碱含量，从而提高烟叶的可用性。对于已经成熟采收了的烟叶，就只能采用第2和3种方法。其中，使用溶剂抽提等化学方法虽然可以去除一部分烟碱，但同时会引起烟草中的一些致香成分的损失和外观色泽的显著变化，从而在一定程度上降低了处理烟叶的可用性。而通过微生物或酶来处理烟叶，由于酶具有专ー性，因此可以较好地避免这些问题。在微生物降解烟碱方面，C. Enders等早在1947年就对酵母降解烟碱进行了研究，以后逐渐成为人们关注的课题。国外一些大的烟草企业如菲利普莫瑞斯烟草公司、英美烟草公司等很早就利用微生物对烟草中的烟碱进行降解，以此来满足一部分消费群体对低尼古丁香烟的需求。目前已报道的能够降解烟碱的微生物主要包括2大类酵母和细菌。国夕卜报追如 Deharyomyces nicotianae,Micrococus nicotianae,Pseudomonas, Alcaligenesparadox us, Arthrobacterglobif ormils, Enterobacter cloacae, Cunninghamellaechinulata, Nicotianae plumbaginif olia, Artnrobacter oxidans 等。国内孙君社等(2002)从烟叶仓库或露天烟垛周围的土壌中分离出降解烟草烟碱的烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae)。利用微生物来处理烟叶,不仅降解了烟叶中的烟碱，改善烟叶的品质，还减少对环境的污染，提高烟叶资源的利用率，具有较高的经济效益和社会效益。因此，筛选能够高效降解烟碱的微生物，用于处理烟草烟叶中的烟碱，具有广泛的应用前景。在已报道的烟碱降解菌中，尚未有利用微杆菌降解烟碱的报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种能够高效降解烟碱的微生物菌株即微杆菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29)，保藏号为 CCTCC NO :M2010311，及其相应的培养条件并公开ー种利用微生物降解烟草中的烟碱提高烟叶可用性的方法。本专利技术通过如下方案实现ー种微生物菌株,其特征在于它为微杆菌Microbacterium sp. GYC29,保藏号为CCTCC NO M2010311 ;菌落黄色，表面光滑不透明边缘整齐；革兰氏阳性，最适生长温度为25-30 °C。所述菌株通过如下途径获得将植烟土壤分别取IOg加入到含有200mL无菌水的三角瓶中，于30°C，200rpm的摇床摇30min，过滤，取ImL细菌悬液转接至另ー个含200mL富集培养基的三角瓶中，富集培养3d，然后取ImL培养物转接至另ー个含200mL烟碱浓度为O. 2%的烟碱培养基的三角瓶中培养3d。将培养物稀释涂布到烟碱选择培养基上，经分离纯化和耐受烟碱能力试验，获得在O. 8%烟碱浓度培养液中可以旺盛生长的降解烟碱菌株，即微杆菌Microbacteriumsp.GYC29。所述富集培养基为蛋白胨10g，酵母提取物5. 0g，NaCl 10g，Ig K2HPO4,水1000ml, ρΗ7· O。所述烟碱培养基为0.2w/v % 烟碱，13. 3g K2HPO4 · 3H20，4g KH2PO4,0. 2g MgSO4 · 7Η20，0· 05ml 微量元素，水 1000ml, ρΗ7· O。所述微量元素为0.04g CaCl2,0. 07g CuSO4,0. 008g MnSO4 · H2O, O. 004gFeSO4 · 7Η20，0· Ig Na2MoO4 · 2H20，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 IOOmL0所述烟碱选择培养基为烟碱培养基+1. 5W/v%琼脂粉。所述菌株的培养步骤为A、斜面培养蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7. 0，将冷冻保存的甘油悬液接种到斜面培养基上，30°C恒温培养2天；B、摇瓶培养烟碱2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，K2HPO4 ·3Η20 13. 3g，KH2PO44g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸馏水1000ml，调pH值为7. 0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10 30v/v%，接种量为2 10v/v%，培养温度为20 40°C，摇床转速为100 200rpm，摇瓶培养I 3天，烟碱降解率达到85 100%。所述微量元素为-.CaCl20. 04g, CuSO4 0. 07g, MnSO4 · H2O 0. 008g, FeSO4 · 7H200. 004g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg,加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。所述微杆菌Microbacterium sp. GYC29用于降解烟草中的烟碱；所说的用于降解烟草中的烟碱,通过如下步骤获得A、将权利要求I所述的微杆菌Microbacterium sp. GYC29进行发酵培养,获得发酵液及菌体；B、将步骤a所得的发酵液或菌体用水、生理盐水或者缓冲液进行稀释，稀释后菌液浓度达到IO6 IO12个菌/ml，将菌液按照烟叶重量的I 5%，加入到含水量为10 50%的烟草中进行发酵，发酵温度为10 50°C，发酵时间不低于4小吋。其中步骤B中所说的缓冲液为巴比妥缓冲液、邻苯ニ甲酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意ー种。培养后的发酵液经稀释后菌液浓度达到IO9个/ml，将菌液按照烟叶重量的I 5%，加入到含水量为10 50%的烟草中，发酵6 72小时，可使烟叶烟碱含量降低，刺激性明显減少，烟气醇和，烟叶可用性明显提高。所述微杆菌Microbacterium sp. GYC29,已于2010年11月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO :M2010311。保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山，邮政编码430072。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为采用本专利技术来改善烟叶原料尤其是上部烟叶的品质，エ艺过程简单，反应条件温和；经过处理后，烟叶烟碱含量降低 ，刺激性明显減少，烟气醇和，烟叶可用性明显提高。该方法具有简单实用，成本低廉等特点，可望在エ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种微生物菌株,其特征在于它为微杆菌Microbacterium sp. GYC29,保藏号为CCTCC NO M2010311 ;菌落黄色，表面光滑不透明边缘整齐；革兰氏阳性，最适生长温度为25-30 °C。2.如权利要求I所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株通过如下途径获得 首先从土壤或者烟叶中分离出降解烟草烟碱的微生物菌株；然后将获得的微生物菌株用烟碱选择培养基进行筛选，经分离纯化和耐受烟碱能力试验，获得可以高效降解烟碱的菌株，即微杆菌 Microbacterium sp. GYC29。3.如权利要求I或2所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株的培养步骤为 A、斜面培养蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水IOOOml，ρΗ7·0，将冷冻保存的甘油悬液接种到斜面培养基上，30°C恒温培养2天； B、摇瓶培养烟碱2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，K2HPO4·3Η20 13. 3g,KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸馏水1000ml，调pH值为7. 0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10 30v/v%，接种量为2 10v/v%，培养温度为20 40°C，摇床转速为100 200rpm，摇瓶培...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙章德，黄泰松，韦建玉，白森，邹克兴，胡亚杰，蔡联合，金亚波，张纪利，
申请(专利权)人：广西中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：