本发明专利技术涉及一种快速建立瓶霉属（Phialophora）真菌与农作物共生培养体系的方法，属于应用微生物学、植物营养学和生态学领域。本发明专利技术利用高温灭菌后的玉米糁培养瓶霉属真菌，再将其与无菌的培养基质混合作为接种剂，将无菌农作物种子播于接种剂上萌发，从而在育苗期快速建立瓶霉属真菌-农作物的共生培养体系。具体包括瓶霉属真菌培养、接种剂准备、种子表面消毒、共生体系的建立、共生体系镜检、及分菌复检步骤。本发明专利技术的有益效果在于：能在农作物育苗的同时即进行瓶霉属真菌接种，能在苗期成功定殖上瓶霉属真菌，操作简单，大大缩短育苗时间，能够应用于瓶霉属真菌与农作物相互关系研究，对于农作物的大面积栽培具有重要理论和实际意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物学、植物营养学和生态学领域。具体涉及一种快速建立瓶霉属真菌与农作物共生培养体系的方法。
技术介绍
研究发现瓶霉属真菌(/5AiaJojDAora spp.)是植物根系内生真菌的最优势类群之一，属于深色有隔内生真菌(Dark Sepatate Endophytes, DSE)范畴。随着研究的深入，发现这些DSE真菌能发挥类似丛枝菌根真菌的生态学功能，其在植物营养吸收(特别是N、P)、抗逆性、抗病性中都发挥着重要作用，比如瓶霉属真菌(/5AiaJojDAora sp.1-52)对小麦全蚀病(Take-all disease of wheat)的生物防治等。此外，瓶霉属真菌有更广泛的宿主范围，能够与非菌根植物如十字花科植物白菜、拟南芥等形成良好的共生关系，其研究、应用前景十分广阔。现行的瓶霉属真菌-农作物共生培养体系大多借助丛枝菌根真菌研究方法，或者在农作物生长一定阶段再进行接种，比如番茄一般接种时间为二叶一心期，其存在消耗时间长、效率低、不利于大面积推广等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种快速建立瓶霉属真菌与农作物共生培养体系的方法。本专利技术的快速建立瓶霉属真菌与农作物共生体系的方法，其具体步骤如下: (1)瓶霉属真菌培养:将冷冻保藏于试管斜面上的瓶霉属真菌活化后，转接于PDA培养基平板上，在28 °(:恒温培养箱中倒置培养20天；分别沿菌落边缘打出Φ6 mm菌块备用； (2)接种剂准备:取普通生玉米糁6g置于250 ml三角瓶中，加水没过玉米糁并浸泡2小时后滤出多余水分，灭菌后冷却至室温，接种3块直径6 mm菌块，28 °C培养20天作为接种剂备用； (3)种子表面消毒:将农作物种子经体积比为70%乙醇消毒5min，无菌水冲洗3次，再用体积比3%的次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗3次，消毒好后备用； (4)共生体系的建立:取300g灭菌基质与已培养好的上述接种剂混匀，并均匀撒在含有2/3体积培养基质的花盆上层，厚度2 cm，然后播种经表面消毒的农作物种子30粒；置于光照培养箱中，培养条件为:光强度2000 Lux,光照时间12小时，温度为25 V，培养20天; (5)共生体系镜检:20天后，抽取5颗农作物幼苗镜检根系内瓶霉属真菌定殖情况，具体为:完整取出所选幼苗，用水洗净并剪取根基部3 cm长根段5条放入试管，添加质量比10%K0H溶液至根样完全浸没，于90 °C水浴锅中解离至根样透明，再经常规的酸性品红染色、乳酸中和以及乳酸甘油脱色后制片，在显微镜下观察瓶霉属真菌定殖情况，当观察到根内有深色有隔菌丝、微菌核等典型瓶霉属真菌特征结构，初步判断定殖成功。(6)分菌复检:选取初步判断已成功定殖上瓶霉属真菌的农作物根段，按常规的植物内生菌分离方法检测根内定殖真菌是否为所接菌种；选取的根段经过表面消毒后置于PDA平板上培养分离真菌，并将分离得到的真菌与原接种菌进行形态学特征比较，进一步验证瓶霉属真菌-农作物共生体系建立情况。上述步骤(I)中的瓶霉属真菌培养所用PDA为常规的培养基，其配方为:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加水定容至I L，PH自然。上述步骤(2)中玉米糁灭菌条件为121 °(:高温灭菌30分钟。上述步骤(4)中培养基质为普通黄土:腐殖土:珍珠岩按体积比为:2:2:1，灭菌条件为121 °(:高温灭菌2小时，重复3次间歇灭菌，每次间隔48小时。上述步骤(6)中农作物根段表面消毒条件为:体积比70%的乙醇浸泡I min，无菌水清洗3次，体积比10%次氯酸钠浸泡2 min,无菌水清洗3次。本专利技术方法所用瓶霉属真菌来源于云南大学微生物重点实验室。本专利技术的有益效果在于:能在农作物育苗的同时即进行瓶霉属真菌接种，能在苗期成功定殖上瓶霉属真菌，操作简单，大大缩短育苗时间，能够应用于瓶霉属真菌与农作物相互关系研究，对于农作物的大面积栽培具有重要理论和实际意义。【具体实施方式】以下为本专利技术的具体实施案例，本专利技术的保护范围不局限于所述案例。实施例所用瓶霉属真菌来源于云南大学微生物重点实验室。实施例所用方法同
技术实现思路
部分所述。实施例1 ??瓶募属i Ph i a I ophora sp.)真菌-番前共生体系培养 1、瓶霉属真菌培养:将冷冻保藏于试管斜面上的瓶霉属真菌K36、A204、Z48、L45a菌株活化后，分别培养于常规的PDA培养基平板上，在28 °(:恒温培养箱中倒置培养20天；分别沿菌落边缘打出直径为6 mm菌块备用。2、接种剂准备:取普通生玉米糁6 g置于250 ml三角瓶中，加水没过玉米糁并浸泡2小时后滤出多余水分，121 °(:高温灭菌30min后，冷却到室温，分别接入3块直径6 mm菌块，28 °C培养20天作为接种剂备用。3、种子表面消毒:将番茄种子经体积比为70%乙醇消毒5 min,无菌水冲洗3次，再用体积比3%的次氯酸钠消毒5 min,无菌水冲洗3次，消毒好后备用。4、共生体系的建立:将培养基质按普通黄土:腐殖土:珍珠岩按体积比为:2:2:1混合，121 0C高温灭菌2小时，共三次，每次间隔48小时。冷却到室温后，各取300 g无菌基质分别与已培养好的上述玉米糁混合，并各自均匀撒在含有2/3体积培养基质的花盆上层，厚度2 cm，然后每盆均匀播种表面消毒过的番茄种子30粒，置于光照培养箱中，培养条件为:光强度2000 Lux，光照时间12小时，温度为25 °C，培养20天。5、共生体系镜检:20天后，各抽取5颗番茄幼苗镜检根系内瓶霉属真菌定殖情况，具体为:完整取出所选幼苗，用水洗净并剪取根基部3 cm长根段5条放入试管，添加质量比10%K0H溶液至根样完全浸没，于90 °C水浴锅中解离至根样透明，再经常规的酸性品红染色、乳酸中和以及乳酸甘油脱色后制片，在显微镜下观察瓶霉属真菌定殖情况，当观察到根内有深色有隔菌丝、微菌核等典型瓶霉属真菌特征结构，初步判断定殖成功。6、分菌复检:随机选取初步判断已成功定殖上瓶霉属真菌的番茄根段5条，经过体积比70%的乙醇浸泡I min，无菌水清洗3次，体积比10%次氯酸钠浸泡2 min,无菌水清洗3次，置于无菌滤纸上吸干水分，置于PDA平板上，28 °(:恒温培养20天，分离得到与原接种剂形态及解剖学特征相同的瓶霉属真菌，进一步表明瓶霉属真菌-番茄共生体系建立成功。实施例2 -MM属1.Ph i a I ophora sp.)真菌-黄瓜共生体系培养 本实施例所用瓶霉属真菌编号为K36、A204、Z48、L45a，宿主植物为黄瓜，具体实施步骤同实施例1，培养20天后通过0LYPUS-BX51显微镜镜检观察到深色有隔菌丝、微菌核，且通过分菌复检后分别得到了与原接种剂形态及解剖学特征相同的瓶霉属真菌，表明瓶霉属真菌-黄瓜共生体系建立成功。【主权项】1.，利用无菌玉米糁培养瓶霉属真菌为接种材料，接种经表面消毒的农作物种子，在育苗期快速建立瓶霉属真菌-农作物共生培养体系，其具体操作步骤如下: (1)瓶霉属真菌培养:将冷冻保藏于试管斜面上的瓶霉属真菌活化后，转接于PDA培养基平板上，在28 °(:恒温培养箱中倒置培养20天；分别沿菌落边缘打出Φ6 mm菌块备用； (本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速建立瓶霉属真菌与农作物共生体系的方法，利用无菌玉米糁培养瓶霉属真菌为接种材料，接种经表面消毒的农作物种子，在育苗期快速建立瓶霉属真菌‑农作物共生培养体系，其具体操作步骤如下：（1）瓶霉属真菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的瓶霉属真菌活化后，转接于PDA培养基平板上，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养20天；分别沿菌落边缘打出Φ6 mm菌块备用；（2）接种剂准备：取普通生玉米糁6 g置于250 ml三角瓶中，加水没过玉米糁并浸泡2小时后滤出多余水分，灭菌后冷却至室温，接种3块直径6 mm菌块，28 ℃培养20天作为接种剂备用；（3）种子表面消毒：将农作物种子经体积比为70%乙醇消毒5 min，无菌水冲洗3次，再用体积比3%的次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗3次，消毒好后备用；（4）共生体系的建立：取300 g灭菌基质与已培养好的上述接种剂混匀，并均匀撒在含有2/3体积培养基质的花盆上层，厚度2 cm，然后播种经表面消毒的农作物种子30粒；置于光照培养箱中，培养条件为：光强度2000 Lux，光照时间12小时，温度为25 ℃，培养20天；（5）共生体系镜检：20天后，抽取5颗农作物幼苗镜检根系内瓶霉属真菌定殖情况，具体为：完整取出所选幼苗，用水洗净并剪取根基部3 cm长根段5条放入试管，添加质量比10%KOH溶液至根样完全浸没，于90 ℃水浴锅中解离至根样透明，再经常规的酸性品红染色、乳酸中和以及乳酸甘油脱色后制片，在显微镜下观察瓶霉属真菌定殖情况，当观察到根内有深色有隔菌丝、微菌核等典型瓶霉属真菌特征结构，初步判断定殖成功；（6）分菌复检：选取初步判断已成功定殖上瓶霉属真菌的农作物根段，按照植物内生菌分离方法检测根内定殖真菌是否为所接菌种，选取的根段经过表面消毒后置于PDA平板上培养分离真菌，并将分离得到的真菌与原接种菌进行形态学特征比较，进一步验证瓶霉属真菌‑农作物共生体系建立情况。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王超君，李涛，赵之伟，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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