一种快速组织培养石斛种苗的方法技术

本发明专利技术属于种植技术领域，具体涉及一种快速组织培养石斛种苗方法，所述的栽培方法包括：步骤1：共生真菌的分离及培养；步骤2：石斛组培苗的培养；步骤3：组培苗与共生菌共同培养；步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养。本发明专利技术所述的方法能快速获得石斛种苗且成活率达98％。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于种植
，具体涉及一种快速组织培养石斛种苗方法，所述的栽培方法包括：步骤1：共生真菌的分离及培养；步骤2：石斛组培苗的培养；步骤3：组培苗与共生菌共同培养；步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养。本专利技术所述的方法能快速获得石斛种苗且成活率达98％。【专利说明】
本专利技术属于种植
，具体涉及一种快速组织培养石斛种苗方法。
技术介绍
石斛为我国传统名贵中药材，我国历版药典均有记载。中药石斛的原植物为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生草本植物。石斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效，常用于热病伤津、口干烦燥、病后虚热等多种病症。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管的作用。但由于人们长期无节制的采挖使自然资源枯竭，再加上铁皮石斛本身的繁殖率极低，现铁皮石斛成为国家重点保护的药材品种之一。因此人工种植铁皮石斛具有广阔的前景，但缺乏优质种苗是铁皮石斛种植业的瓶颈之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开发出，成活率达98%。本专利技术通过下述技术方案实现的:一种快速组织培养石斛种苗方法，其特征包括以下步骤:，包括如下步骤:步骤1:共生真菌的分离及培养A.共生真菌的分离与纯化采取野生石斛的生活根，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分钟，无菌水冲洗3-5次；切为0.05-0.3cm2的组织段接种到共生真菌培养基上培养，培养条件为:20-30°C，黑暗培养；当切口边缘长出真菌菌丝时，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化获得纯菌株；所述共生真菌培养基为:葡萄糖或蔗糖10-40g / L、燕麦粉IO-1OOg / L、松萝汁l-150g / L、氯霉素或青霉素0.001-lg / L、磷酸二氢钾0.01-1Og / L、硫酸镁0.01-1Og /L、酵母浸膏1-1Og / L、琼脂l-30g / L，pH值为4-9，灭菌条件为:121°C、20分钟；B.共生真菌的发酵培养将菌根真菌的斜面试管菌种活化后，转接于共生真菌培养基中，于20_30°C恒温培养1-30天，在菌落边缘取菌块接入液体共生真菌培养基中进行发酵培养；接入量按重量计为1_10%，振荡转速20-300转/分钟，20-30°C暗培养1-60天；步骤2:石斛组培苗的培养A.原球茎和丛生芽的诱导取野生石斛当年生的嫩芽，用0.1 %升汞溶液灭菌2-10分钟，无菌水冲洗3-5次后，剪取0.5-3厘米带节的茎段，接种到诱导培养基上，在培养温度10-30°C条件下，培养3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小时/天；所述诱导培养基为:MS、6-苄基嘌呤0.1-1Omg / L、萘乙酸0.1-1Omg / L、蔗糖10-40g / L、松萝汁 20-200g / L、琼脂 l_30g / L，pH4_9 ;B.壮苗生根培养将丛生芽转接至培养基I上培养5-50天，培养条件为:光照强度为1000Lx~3000Lx，光照周期为光照/黑暗=14h / 10h，温度20-30°C;株高达2cm以上时转接至培养基2培养10-50天，培养条件为:光照强度为2000Lx~3000Lx，光照周期为光照/黑暗=14h /IOh，温度 20-30 0C ；所述培养基I 为:1 / 2MS、蔗糖 10-40g / L、松萝汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、琼脂 l-30g / L，pH4-9 ；所述培养基2 为:1 / 2MS、蔗糖 10-40g / L、松萝汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、活性炭 0.1-1Og / L、琼脂 l-30g / L，pH4_9 ；步骤3:组培苗与共生菌共同培养取共生菌液体菌种I~30%接种于共生培养基中，在20-30°C下暗培养3-9天后，再将组培苗接入共培养10-50天；共培养条件:光照强度为1000-3000LX，光照周期为:光照/黑暗=14h / 10h，温度 20-30 0C ；共生培养基为:1 / 2MS培养基、马铃薯100-300g / L、蔗糖20_40g / L、松萝汁20-200g / L、肌醇 20-200mg / L、琼脂 l_30g / L, ρΗ4.0-9.0 ；步骤4:菌根化组培苗的炼苗培养Α.自然光照下在瓶中炼苗5-10天；B.将菌根化成功的组培苗从玻璃瓶中取出，在0.1 %的高锰酸钾溶液中浸泡3-9分钟后晾干栽种到塑料盆中，温度15-35°C、湿度40-80%和遮阳率为50-70%的条件下培养，炼苗期3-12个月；栽培基质为经121°C高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。所述步骤I进一步为:A.共生真菌的分离与纯化采取野生石斛的生活根，在流水下冲洗5-10分钟，并用毛刷去除表面附着物，然后放置于吸水纸上，用72 %酒精冲洗一下，无菌水冲洗3-5次后，0.1 %升汞溶液浸泡2-5分钟，无菌水冲洗4次；把细跟切为0.05-0.3cm2的组织段接种到共生真菌培养基上培养，培养条件为:20-30°C，黑暗培养；当切口边缘长出真菌菌丝时，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化获得纯菌株；所述共生真菌培养基为:葡萄糖或蔗糖10_40g / L、燕麦粉IO-1OOg / L、松萝汁l-150g / L、氯霉素或青霉素0.001-lg / L、磷酸二氢钾0.01-1Og / L、硫酸镁0.01-1Og /L、酵母浸膏1-1Og / L、琼脂l-30g / L，pH值为4-9，灭菌条件为:121°C、20分钟；B.共生真菌的发酵培养将菌根真菌的斜面试管菌种活化后，转接于共生真菌培养基中，于20_30°C恒温培养1-30天，在菌落边缘取小菌块接入液体共生真菌培养基中进行发酵培养；接入量按重量计为1-10% ;振荡转速20-300转/分钟，20-30°C暗培养1-60天。所述步骤2的A进一步为:A.原球茎和丛生芽的诱导:取野生石斛当年生具3-5个节的嫩芽，去除叶片后，在流水下冲洗5-10分钟，在超净工作台上用70%的酒精浸泡1-3分钟，再用0.1 %升汞溶液灭菌2-10分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌吸水纸吸干，剪取0.5-3厘米带节的茎段，接种到诱导培养基上，在培养温度10-30°C条件下，培养3-30天；光照度1000~2500Lx，光照12小时/天；所述诱导培养基为:MS、6-苄基嘌呤0.1-1Omg / L、萘乙酸0.1-1Omg / L、蔗糖10-40g / L、松萝汁 20-200g / L、琼脂 l_30g / L，pH4_9。所述步骤2的B进一步为:B.壮苗生根培养:将利用茎段诱导的丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽转接至培养基I上培养5-50天，培养条件为:光照强度为lOOOLx~3000Lx，光照周期为光照/黑暗=14h / 10h，温度20-30°C ;株高可达2cm以上时转接至培养基2培养10-50天，培养条件为:光照强度为2000Lx~3000Lx，光照周期为光照/黑暗=14h / 10h，温度20-30 °C ；所述培养基I 为:1 / 2Ms、蔗糖 10-40g / L、松萝汁 20_200g / L、香蕉 10_40g /L、琼脂 l-30g / L，pH4-9 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速组织培养石斛种苗的方法，包括如下步骤： 步骤1：共生真菌的分离及培养 A.共生真菌的分离与纯化 采取野生石斛的生活根，0.1％升汞溶液浸泡2‑5分钟，无菌水冲洗3‑5次；切为0.05‑0.3cm2的组织段接种到共生真菌培养基上培养，培养条件为：20‑30℃，黑暗培养；当切口边缘长出真菌菌丝时，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化获得纯菌株； 所述共生真菌培养基为：葡萄糖或蔗糖10‑40g／L、燕麦粉10‑100g/L、松萝汁1‑150g/L、氯霉素或青霉素0.001‑1g／L、磷酸二氢钾0.01‑10g／L、硫酸镁0.01‑10g／L、酵母浸膏1‑10g/L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9，灭菌条件为：121℃、20分钟； B.共生真菌的发酵培养 将菌根真菌的斜面试管菌种活化后，转接于共生真菌培养基中，于20‑30℃恒温培养1‑30天，在菌落边缘取菌块接入液体共生真菌培养基中进行发酵培养；接入量按重量计为1‑10％，振荡转速20‑300转／分钟，20‑30℃暗培养1‑60天； 步骤2：石斛组培苗的培养 A.原球茎和丛生芽的诱导 取野生石斛当年生的嫩芽，用0.1％升汞溶液灭菌2‑10分钟，无菌水冲洗3‑5次后，剪取0.5‑3厘米带节的茎段，接种到诱导培养基上，在培养温度10‑30℃条件下，培养3‑30天；光照度1000～2500Lx，光照12小时／天； 所述诱导培养基为：MS、6‑苄基嘌呤0.1‑10mg／L、萘乙酸0.1‑10mg／L、蔗 糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； B.壮苗生根培养 将丛生芽转接至培养基1上培养5‑50天，培养条件为：光照强度为1000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃；株高达2cm以上时转接至培养基2培养10‑50天，培养条件为：光照强度为2000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃； 所述培养基1为：1／2MS、蔗糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、香蕉10‑40g／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； 所述培养基2为：1／2MS、蔗糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、香蕉10‑40g／L、活性炭0.1‑10g／L、琼脂1‑30g/L，pH4‑9； 步骤3：组培苗与共生菌共同培养 取共生菌液体菌种1～30％接种于共生培养基中，在20‑30℃下暗培养3‑9天后，再将组培苗接入共培养10‑50天； 共培养条件：光照强度为1000‑3000Lx，光照周期为：光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃； 共生培养基为：1／2MS培养基、马铃薯100‑300g/L、蔗糖20‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、肌醇20‑200mg／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； 步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养 A.自然光照下在瓶中炼苗5‑10天； B.将菌根化成功的组培苗从玻璃瓶中取出，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡3‑9分钟后晾干栽种到塑料盆中，在温度15‑35℃、湿度40‑80％和遮阳率为 50‑70％的条件下培养，炼苗期3‑12个月；栽培基质为经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭景龙，潘启仁，吴小生，刘焱晶，陈春，彭中胜，王泽雨，
申请(专利权)人：贵州清控置业有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52