本发明专利技术涉及一种利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法，属于微生物应用技术领域。本发明专利技术从土壤中筛选到一株具降解三唑醇的耐硼赖氨酸芽孢杆菌新菌株SCT‑1，CCTCC NO:M 2016349；进而提出利用该菌株降解土壤中三唑醇的方法，包括培养基的配制；菌种的活化培养；降解菌剂制备及在污染土壤中应用及样品中三唑醇残留量的测定等步骤。该方法在较佳工艺条件下，30天内对土壤中三唑醇的降解率可达61％，具有快速、高效、简单、实用等特点。可在受三唑醇污染土壤地区的降解处理中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物应用
，尤其涉及一种利用新的微生物菌株，降解被三唑醇污染土壤的方法。
技术介绍
三唑醇是德国拜尔公司开发的一种三唑类杀菌剂，由于其具有高效、广谱、残效期长和内吸传导性强等特性，对作物具有保护和治疗作用,广泛应用于水果和禾谷类等农作物上。三唑醇本身是杀菌剂，又是三唑酮的主要代谢产物，具有神经毒性，对啮齿类动物胚胎咽部形态有一定影响，能够通过改变正常后脑发育模式使小鼠胚胎发生严重畸形，有致畸作用。不同浓度的三唑醇对人肝细胞具有不同毒性：低浓度时，显著促进细胞增殖，并且随着浓度的增大，促进作用增大；在高浓度时，显著抑制细胞的增殖，当浓度大于222.584μg/mL时，细胞全部死亡。三唑醇在pH4～7(20℃和40℃)条件下十分难水解(very persistent)，降解半衰期＞250天，在土壤中降解半衰期为47.3-250天，属于在土壤中比较难降解的农药(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm)，随着其大量使用，势必会导致其在土壤中残留，因此极容易造成在农产品中超标，进而对人体健康和国际贸易产生影响。目前欧盟和日本已对该农药在食品中的残留量作出了严格的限制，如日本肯定列表规定多数食品中三唑醇的残留量不得超过0.1mg/kg。2007年1月欧盟公布了进口的中国产蜂蜜中检测出三唑醇残留量超标的预警通报。同年由于辣椒中三唑醇超标，出口日本的农产品被扣押。2010年至今，我国出口日本的胡萝卜每年均有因三唑醇超标而被扣押的事件发生。因此，三唑醇残留引起的农产品安全问题亟待解决。与物理和化学去除技术相比，生物降解技术具有经济性强、二次污染少， 去除效率高等显著优点，是迄今为止处理环境和农产品污染一种较好的方法，具有广阔的应用前景。介质中微生物的选择性降解是环境中农药的主要降解途径。但目前还没有有关微生物降解三唑醇的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对目前三唑醇残留问题，提供一种降解三唑醇效能较高的新微生物菌株；其次是提供一套利用该菌株快速、高效降解污染土壤中三唑醇的方法。以下是本专利技术技术方案的详细描述。微生物菌株的筛选与鉴定：本专利技术从浙江省某农药厂取土样5份，活性污泥2份，一共7份样品，取完后在12h之内迅速筛选菌种，筛选的具体方法是：将样品在含三唑醇的富集培养基中逐步富集培养后，再在含三唑醇的无机盐培养基中驯化2-5次，然后涂布于普通培养基平板上进行分离、纯化；最后经过液体培养基中的降解试验，最终得目标菌株SCT-1。本专利技术筛选得到的菌株SCT-1，委托武汉大学中国典型培养物保藏中心对其进行16S rRNA基因序列的测定与分析、菌株的形态观察、生理生化特性鉴定。根据上述结果确定该菌株为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)，革兰氏阳性。生物样品材料保藏：耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)菌株SCT-1已于2016年6月24日保存在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:M 2016349。根据以上微生物学特征鉴定，该新菌株SCT-1属于耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)，该株微生物不属于现己公开专利菌种的任何一种，该株微生物具有降解三唑醇的能力，可以用于土壤中三唑醇的降解。一种利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法，该方法按以下步骤进行：(1)普通培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，经灭菌后，备用；(2)菌种发酵培养基：(NH4)2SO4 1.0g，FeSO4·7H2O 0.005g，CaSO40.08g，Na2MoO4·2H2O 0.0033g，MgSO4 0.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，经灭菌后，备用；(3)种子液的制备：挑取1环耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)斜面保藏菌株SCT-1CCTCC NO:M2016349，接入步骤(1)培养基，于30℃、180rpm条件下振荡培养24h后得到种子液，备用；(4)降解菌剂的制备：将步骤(3)种子液按体积5％接种量接入步骤(2)培养基中；于30℃、180rpm条件下振荡培养48h后得到降解菌剂，备用；(5)降解菌剂对土壤中三唑醇的降解：将步骤(4)降解菌剂与含三唑醇的土壤样品按重量1︰10的比例，混匀，利用菌体降解7-30d；(6)土壤样品三唑醇残留量的测定：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行三唑醇残留量的测定；土壤样品用100mL丙酮/蒸馏水(V/V，5/1)振荡提取2h后过滤，滤渣用40mL丙酮/蒸馏水(V/V，5/1)分3次洗涤，合并滤液于旋转蒸发仪上减压抽去丙酮。浓缩液中加入50mL饱和氯化钠水溶液，依次用50、40和30mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，浓缩至2mL左右。玻璃层析柱内依次加入2g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和2g无水硫酸钠，将提取液转移至柱内，用50mL二氯甲烷/丙酮(V/V＝9/1)淋洗，收集洗脱液，浓缩至1mL，用甲醇定容至10mL，进行高效液相色谱仪检测条件：检测波长223nm，流动相为甲醇：水(V:V＝70:30)，流速为0.8mL/min，采用SUPELCO C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，进样量为20μL，柱温为25℃。三唑醇的出峰时间为7.12min，可测定出样品中三唑醇的含量，并计算出菌种对三唑醇的降解率。所述的方法，其中所述降解菌剂发酵培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：(NH4)2SO4 1.0g，FeSO4·7H2O 0.005g，CaSO4 0.08g，Na2MoO4·2H2O 0.0033g，MgSO40.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。所述的方法，其中所述培养条件为：温度30℃，初始pH为7.0，在搅拌、通风、振荡条件下培养48h。菌种保藏信息耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)菌株SCT-1，保存在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:M 2016349，保藏日期为：2016年6月24日。有益效果一、本专利技术从微生物群中筛选得到可降解三唑醇的耐硼赖氨酸芽孢杆菌SCT-1：CCTCC NO:M 2016349，其在适合条件下，能有效降解三唑醇。二、本专利技术将耐硼赖氨酸芽孢杆菌SCT-1用于土壤中三唑醇的降解实验，结果表明，该菌可有效降解土壤中的三唑醇，30天内三唑醇最高降解率达到61％(见实施例3、4、5、6)，因此该菌在降解土壤中三唑醇的领域中具有较广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术筛选的E-9菌株显微镜(1000X)观察照片。图2为本专利技术筛选的E-9菌株的平板菌落形态结果图。图3为本专利技术筛选的E-9菌株的电镜照片。图4为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三唑醇农药降解菌，该菌株为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)，其保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016349的SCT‑1菌株。
【技术特征摘要】
1.一种三唑醇农药降解菌，该菌株为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)，其保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016349的SCT-1菌株。2.一种利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)菌种活化培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0,经灭菌后，备用；(2)菌种发酵培养基：(NH4)2SO4 1.0g，FeSO4·7H2O 0.005g，CaSO4 0.08g，Na2MoO4·2H2O 0.0033g，MgSO4 0.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，经灭菌后，备用；(3)种子液的制备：挑取1环耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)斜面保藏菌株SCT-1，接入步骤(1)培养基，于30℃、180rpm条件下振荡培养24h后得到种子液，备用，其中该菌株被保藏在武汉大学中国典型...
【专利技术属性】
技术研发人员：张春荣，平立凤，何红梅，吴珉，朱亚红，俞建忠，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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