一株微生物菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株微生物菌株及其应用，具体涉及一种能够兼产淀粉酶和蛋白酶的烟草烟碱降解菌——烟草节杆菌(Arthrobacter?nicotianae?GYC103)CCTCC?NO：M2010312及其在烟草中的应用。本发明专利技术所说的菌株在生长过程中可以分解利用烟碱并产生淀粉酶和蛋白酶。将该菌株的发酵液或菌体按照烟叶重量的1～5％，加入到含水量为10～50％的烟草中，发酵6～72小时可以使烟叶的烟碱含量降低2～20％，淀粉含量降低10～35％，蛋白质含量降低5～25％，烟叶刺激性明显减少，杂气减少，烟气柔和，烟香增加，感官质量明显改善。本发明专利技术通过使用微生物来实现降解烟草烟碱、淀粉和蛋白质的目的，可以适当调整烟叶原料的烟碱、淀粉和蛋白质的含量大小，提高烟叶的可用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株微生物菌株及其应用，具体涉及ー种能够兼产淀粉酶和蛋白酶的烟草烟喊降解菌-烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae GYC103) CCTCC NO M2010312及其在烟草中的应用，属于微生物应用

技术介绍
烟碱又名尼古丁(Nicotine)，是烟草生物碱中的主要成分。烤烟中烟碱的含量一般在I. 5% 3. 5%,以2. 5%左右为宜。烟碱含量过低，劲头太小，烟碱含量过高，劲头太大，会引起刺呛辛辣感。近年来我国部分地区烟叶外观质量接近国际水平，但烟叶化学成分不太协调，烟碱偏高，尤其是上部烟叶。降低烟草中的烟碱含量，目前主要有三条途径(1)从农业种植的角度进行调控主要从遗传、生态和栽培等方面来进行控制。(2)从化学的角度烟叶中的生物碱可通过用热水漂洗、有机溶剂萃取、气体抽提和蒸汽蒸馏等处理烟叶的方法将烟叶中的烟碱脱棹。(3)从微生物和酶的角度从烟叶、烟籽和土壌中分离能够降解烟碱的微生物，培养后直接或者分离出酶系后作用于烟叶，降低烟叶中的烟碱含量，从而提高烟叶的可用性。对于已经成熟采收了的烟叶，就只能采用第2和3种方法。其中，使用溶剂抽提等化学方法虽然可以去除一部分烟碱，但同时会引起烟草中的一些致香成分的损失和外观色泽的显著变化，从而在一定程度上降低了处理烟叶的可用性。而通过微生物或酶来处理烟叶，由于酶具有专ー性，因此可以较好地避免这些问题。利用生物制剂处理烟叶可以缩短发酵时间，调控烟叶有害成分如烟碱和TSNA等，促进大分子的物质如蛋白质和淀粉等的转化，增进烟叶香气。在微生物降解烟碱方面，C. Enders等早在1947年就对酵母降解烟碱进行了研究，以后逐渐成为人们关注的课题。国外一些大的烟草企业如菲利普莫瑞斯烟草公司、英美烟草公司等很早就利用微生物对烟草中的烟碱进行降解，以此来满足一部分消费群体对低尼古丁香烟的需求。目前已报道的能够降解烟碱的微生物主要包括2大类酵母和细菌，国外报道如Denaryomyces nicotianae, Micrococusnicotianae, Pseudomonas, Alcaligenes paradoxus, Arthrobacterglobif ormils, Enterobacter cloacae， Cunninghameila echinulata,Nicotianae plumbaginif olia, Arthrobacter oxidans 等。已报道的烟喊降解途径有三条(I)批咯烧途径(pyrrolidine pathway) ； (2)批P定途径(pyridine pathway) ； (3)脱甲基途径(Me pathway)。国内孙君社等(2002)从烟叶仓库或露天烟垛周围的土壤中分离出降解烟草烟碱的烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae),但只提出对降解烟碱有作用。烟叶中除了烟碱外，还有大量的淀粉和蛋白质。以淀粉形式存在的糖类在烟支燃吸时会影响燃烧速度和燃烧完全性，其燃烧时产生糊焦气味，会使烟草香味变坏。蛋白质则是构成细胞的基本材料，它的水解产物和进ー步转化的产物是许多烟草香气物质的原始物质，但蛋白质含量高燃吸时会产生ー种如同燃烧羽毛的蛋白质臭味，降低烟叶的燃烧性，而且是烟气中有害物质的前体，包括奎琳、HCN、和其他含氮化合物，严重影响烟叶的香味品质和安全性。若能筛选获得一株既能降解烟碱，又能降解烟叶淀粉和蛋白质的微生物，对利用生物技术改善我国烟叶尤其是上部烟质量，提高烟叶可用性具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种能够降解烟碱同时产淀粉酶和蛋白酶的微生物菌株即烟草节杆菌 Arthrobacter nicotianae GYC103 (保藏号为 CCTCC NO M2010312)及其相应的产酶培养基和培养条件并公开ー种利用微生物降解烟草中的烟碱、蛋白质和淀粉提高烟叶可用性的方法。本专利技术通过如下方案实现一种微生物菌株，其特征在于它为烟草节杆菌Arthrobacter nicotianaeGYC103，保藏号为CCTCC NO M2010312 ;革兰氏阳性，厌氧阴性，接触酶阳性，氧化酶阴性，明胶液化阴性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐阳性，脲酶阴性，丙ニ酸盐阴性，V-P阴性，耐盐性阳性；葡萄糖阴性，甘露醇阴性，乳糖阴性，蔗糖阴性，麦芽糖阴性，木糖阴性，核糖阴性；在培养基上生长时可见表面光滑不透明、边缘整齐的黄色菌落，最适生长温度为25-30°C。所述菌株通过如下途径获得首先从土壤或者烟叶中分离出降解烟草烟碱的微生物菌株；其次将获得的微生物菌株用牛奶选择培养基进行筛选，获得可以产生蛋白酶的菌株;然后将得到的菌株用淀粉选择培养基筛选能够产生淀粉酶的菌株，获得可以同时降解蛋白质和淀粉的烟碱降解菌，即烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae GYC103。所述菌株的培养步骤为A、斜面培养蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7. 0，将冷冻保存的甘油悬液接种到斜面培养基上，30°C恒温培养2天；B、摇瓶培养烟碱2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，K2HPO4 · 3H2013. 3g,KH2P044g, MgSO4 · 7Η200· 2g，0. 5ml微量元素，加蒸馏水1000ml，调pH值为7. 0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10 30v/v%，接种量为2 10 v/v%,培养温度为20 40°C，摇床转速为100 200rpm，摇瓶培养I 3天，烟碱降解率达到85 100%，蛋白酶活力达到18 60U/ml，淀粉酶活达到10 40U/ml。所述微量元素为CaCl20.04g, CuSO4O. 07g, MnSO4 · H2OO. 008g, FeSO4 · 7Η200· 004g,Na2MoO4 · 2Η200· lg，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。所述微生物菌株可以降解烟草烟碱，在生长过程中可以产生淀粉酶和蛋白酶。所述烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae GYC103用于降解烟草中的烟碱、淀粉和蛋白质；所说的用于降解烟草中的烟碱、淀粉和蛋白质，通过如下步骤获得A、将权利要求I所述的烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae GYC103进行发酵培养，获得发酵液及菌体；B、将步骤a所得的发酵液或菌体用水、生理盐水或者缓冲液进行稀释，稀释后菌液浓度达到IO6 IO12个菌/ml，将菌液按照烟叶重量的I 5%，加入到含水量为10 50%的烟草中进行发酵，发酵温度为10 50°C，发酵时间大于4小吋。其中步骤A中所说的发酵液为巴比妥缓冲液、邻苯ニ甲酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液、硼砂-氯化钙缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意ー种。培养后的发酵液经稀释后菌液浓度达到IO9个/ml，将菌液按照烟叶重量的I 5%，加入到含水量为10 50%的烟草中，发酵6 72小时，可使烟叶烟碱、蛋白质及淀粉含量降低，刺激性明显减少，烟气柔和，烟香增加，烟叶可用性明显提高。所述烟草节杆菌Arthrobacter n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.微生物菌株,其特征在于它为烟草节杆菌Arthrobacternicotianae GYC103,保藏号为 CCTCC NO M2010312o2.如权利要求I所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株为革兰氏阳性，厌氧阴性，接触酶阳性，氧化酶阴性，明胶液化阴性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐阳性，脲酶阴性，丙ニ酸盐阴性，V-P阴性，耐盐性阳性；葡萄糖阴性，甘露醇阴性，乳糖阴性，蔗糖阴性，麦芽糖阴性，木糖阴性，核糖阴性；在培养基上生长时可见表面光滑不透明、边缘整齐的黄色菌落，最适生长温度为25-30°C。3.如权利要求I所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株通过如下途径获得 首先从土壤或者烟叶中分离出降解烟草烟碱的微生物菌株； 其次将获得的微生物菌株用牛奶选择培养基进行筛选，获得可以产生蛋白酶的菌株； 然后将得到的菌株用淀粉选择培养基筛选能够产生淀粉酶的菌株，获得可以同时降解蛋白质和淀粉的烟喊降解菌，即烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae GYC103。4.如权利要求I至3任一所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株的培养步骤为 A、斜面培养蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.O，将冷冻保存的甘油悬液接种到斜面培养基上，30°C恒温培养2天； B、摇瓶培养烟碱2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，K2HPO4· 3Η2013· 3g，KH2P044g,MgSO4 ·7Η200. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸馏水1000ml，调pH值为7. 0，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10 30v/v%，...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙章德，黄泰松，韦建玉，白森，邹克兴，胡亚杰，蔡联合，金亚波，张纪利，
申请(专利权)人：广西中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：