本发明专利技术属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌基因工程菌的构建。本发明专利技术构建得到一株具有杀鳞翅目害虫棉铃虫的同时具有杀桔小实蝇的活性的过表达转录调控因子CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌(Bacillus?thuringiensis)基因工程菌YBT-881-L1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC?NO：M?2011040，该工程菌含有CodY蛋白，它的编码序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示。本发明专利技术还公开了一种新的表达载体，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：3所示。本发明专利技术的YBT-881-L1工程菌不仅对棉铃虫具有很高的杀虫活性，而且对双翅目昆虫也有较高的杀虫活性，而野生型苏云金芽胞杆菌YBT-881仅对棉铃虫有活性，对双翅目昆虫没有杀虫活性。本发明专利技术的基因工程菌可在杀虫微生物农药方面应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物基因工程
，具体涉及ー种过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌YBT-881-L1的筛选及鉴定。本专利技术涉及微生物农药基因工程菌的选育与应用。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是ー种天然存在的昆虫病原细菌，对无脊椎动物中的4个门和节肢动物门中16个目的3000多种害虫有活性。随着研究的深入，cryl基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中已得到广泛的应用。但是，在实验室条件下已经发现了多种昆虫对Bt亚种或单个毒素可以产生抗性，在小菜蛾的田间种群中也已经出现了具有抗性的个体。因此，筛选和克隆新的毒力高、杀虫谱广、不易产生抗性和交互抗性的cry基因和基因组合是解决这些潜在危机的有效途径之一。cry2基因在Bt中分布较广泛，而不同的Cry2类蛋白有着不同的杀虫谱和毒力。其中，Cry2Aa对鳞翅目、双翅目害虫及直翅目的黄胫小车蝗具有杀虫活性；cry2A为沉默基因，但在国内外都已实现了有效表达，并发现Cry2Ab对棉铃虫初孵幼虫具有高毒力，能明显抑制ニ化螟ニ龄幼虫生长；cry2Ac和cry2Ad在苏云金芽胞杆菌中不常见。研究表明，Cry2A类蛋白与CrylA蛋白具有不同的结合位点，害虫对这两种蛋白不容易产生交互抗性。Cry2类蛋白与其它杀虫蛋白之间还具有增效作用。第二代抗虫棉中已出现了转cry2Ab基因或同时转cry2Ab和cryIAc基因的棉花,并且已经在Monsanto公司开始商业化生产。中国也得到了对水稻主要鳞翅目害虫具有抗性的转人工改造的cry2A基因水稻。因此，对cry2基因的研究具有重要的理论和应用价值。生物杀虫剂优于传统农药的最大原因是由于其杀虫能力没有降低，但与传统农药相比有环保和无残留的优点，因此近年来生物杀虫剂得到了全世界范围的关注。目前苏云金芽胞杆菌是全世界使用最广泛、最成功的生物杀虫剂，这个过程经历了近110年的历程。1915年正式将这种有杀虫能力、革兰氏阳性、生存在土壤中的微生物命名为苏云金芽胞杆菌，从发现到得到正式命名经历了 15年(喻子牛，1990)。苏云金芽胞杆菌之所以具有杀虫能力是由于在形成芽胞的同时形成了伴胞晶体，即杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystalproteins, I CPs),这种晶体的杀虫能力是特异性的。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在稳定期大量表达并且以伴胞晶体的形式在母细胞中积累，其表达量可达到整个细胞干重的20-40%。也就是说，每个细胞大约需要合成1-2X IO6 个 ICPs 分子才能组装成这样的晶体(Schnepf and Crickmore, 1998 ；Errington,1993)。因此，苏云金芽胞杆菌内一定存在调节机制来调节cry基因的表达。近来一系列的研究表明，苏云金芽胞杆菌cry基因的高效表达调控机制主要涉及转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次的正向调节，才最終使得cry基因能够高效表达并形成 伴胞晶体。不同的cry基因调控机制也各不相同，即便是同一基因在不同宿主细胞中表达也不相同，说明原毒素的合成存在着错综复杂的调控机制。深入认识这些调控机制，构建高效广谱工程菌具有重要的理论意义和实践意义。全局性转录调控因子CodY广泛存在于G+C含量较低的革兰氏阳性细菌中，它是调节稳定期早期基因和芽胞形成基因转录的全局调控因子，它调控很多基因，包含将近200个基因。这些基因包括一些可产生与大分子降解、营养物质运输、生物代谢、抗生素合成、趋药性等有关的物质。这些基因大都是在快速生长期被阻遏，而营养缺乏时被诱导表达，帮助细胞适应营养匮乏时期。在枯草芽胞杆菌细胞中，CodY通过感知细胞内GTP浓度作为营养条件的指示剂，调节稳定期早期基因和芽胞形成基因的转录。在指数生长期，枯草杆菌细胞中的CodY可被细胞内含量较高的GTP激活成为转录阻遏蛋白，抑制稳定期和芽胞形成基因的转录。当细胞内碳源或者氨基酸含量较少时，生长速率下降，应急反应被激活。产生应急反应的信号是结合有空载tRNA的核糖体，该信号激活与核糖体结合的——RelA, RelA使GTP转化为PPPGpp和ppGpp，细胞内的⑶P和GTP含量下降，这就会导致CodY失去阻遏活性，从而CodY的革巴基因可以正常转录，调节细胞进入稳定期或者形成芽胞(Ratnayake-Lecamwasam M et al.，2001)。因此，(p) ppGpp的积累或GTP含量的减少可能是使CodY调节的靶基因去阻遏的信号。当用德夸菌素(GMP合成抑制剂)处理细胞时，鸟嘌呤核苷酸含量下降，会诱导稳定期基因的表达，也会促使细胞即使在营养丰富的条件下仍然形成芽胞。CodY与GTP相互作用后会增强CodY与其靶基因的亲和力，这种亲和力的增强在BCAAs存在时被进一歩放大。两种不能水解的GTP的类似物也能激活CodY结合到靶DNA上，因此GTP对CodY的效应并不依赖于GTP的水解(Luke D. Handke et al.，2008)。GTP作为CodY的效应分子的证据是由Ratnayake-Lecamwasam等人首次提出的。在他们所做的实验中，ATP可以与带有放射性标记的GTP竞争结合靶DNA，但CTP和UTP却不能。作者提出，CodY体外抑制dpp启动子的能力可被浓度为2mM的GTP极大的刺激，但添加ATP并不能诱导CodY的阻遏效应。由于竞争实验并没有在平衡条件下进行，他们也不排除其他核苷酸作为效应分子的可能性。P. Serror和A. L. Sonenshein发现,BCAAs是枯草杆菌细胞中激活CodY阻遏dpp操纵子的最有效的氨基酸；Guedon等人提出当向乳酸乳球菌的生长培养基中添加含有BCAAs的ニ肽时，会增强CodY对合成胞外蛋白酶的阻遏作用；Bergara等人指出枯草芽胞杆菌细胞中CodY对鞭毛基因的阻遏与向生长培养基中添加BCAAs有夫。为了验证BCAAs是否对CodY与革E位点的结合有直接影响，Robert P. Shivers和Abraham L. Sonenshein等人向CodY与453bp大小的ilvB启动子片段的结合反应中添加lie，Leu, Val各10mM，发现在某种程度上添加BCAAs比GTP对增强CodY与靶位点的亲和カ更有效，表明BCAAs是促使CodY与靶位点结合的直接效应分子；但是否只有BCAAs中的三种氨基酸同时存在时才对CodY的结合能力有影响呢？他们又在GTP存在的条件下，向结合反应中添加单个氨基酸，发现添加BCAAs中的每种氨基酸对CodY结合能力的增强都大于GTP的单独效应，且Ile和Val的效应最大(Anuradha C. Villapakkam et al. ,2010)。因此，枯草杆菌细胞中CodY的活性，依赖于两个效应分子，即GTP和BCAAs。CodY与靶位点的体外结合能力可同时被GTP和BCAAs增强，二者可単独或者协同作用，CodY与GTP相互作用将使CodY与DNA的亲和カ増加四倍。两个效应分子同时存在吋，CodY的活性比它们单独存在时更強。但乳酸乳球菌和肺炎链球菌中的CodY蛋白活性只受BCAAs调控(Robert P.Shivers e本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种具有杀鳞翅目害虫棉铃虫的同时具有杀桔小实蝇的活性的过表达转录调控因子CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)基因工程菌YBT-881-L1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明顺，喻子牛，何进，王阶平，李林，黄凯，梅菲，金鑫，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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