本发明专利技术涉及一种预防鸡疾病方法的疫苗及其制备方法。保藏号为CCTCCM2012100的鸡病原黄杆菌菌株，和含有该菌的疫苗，该疫苗的制备方法为：接种：将鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织一小块放于装有1%TritonX-100的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种；灭活后乳化分装即可。本发明专利技术的疫苗可用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病。制备的灭活疫苗质量确实、可靠，符合要求，安全性高，对鸡群的免疫效果好，抗体水平高，维持期较长，对强菌攻击具有较好的保护效果，同时不影响鸡产蛋。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种禽疫苗，尤其是涉及ー种鸡疾病的疫苗及其制备方法。
技术介绍
长期以来，鸡群由于群居，容易爆发疾病，特别是传染性疾病，比如鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病。鸡群常见的传染性疾病对养殖的影响非常大，如果不预防，将给养殖户带来巨大的经济损失。所以传染性疾病的预防性疫苗就凸现出了重要性。目前还 没有特别有针对性的预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。另外菌种的分离方法多种多样，根据菌的不同来源和其本身的特点分离方法也各不相同，正确的分离培养有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。为实现上述目的，本专利技术提供ー种鸡病原黄杆菌菌株，属黄杆菌科，学名为鸡黄杆菌 001 Flavobacterium sp. 001，保藏号为 CCTCC NO: M 2012100，于 2012 年 4 月 8 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。为得到本专利技术所述的鸡病原黄杆菌菌株，本专利技术还提供了一种分离方法，其步骤为 菌种的分离 取发生传染性肝炎的病鸡肝部组织ー小块(约50mg)放于装有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分别含有氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长； 菌种扩大培养 从上述长菌的平板中挑单菌落到抗生素的250ml LB液体培养基中，37°C摇床培养24-30小时，测0D600约为2. 0 ;其抗生素为同时含有氨苄和卡纳； 菌种鉴定 取上述扩大培养的菌液测序，得出所测的菌种是黄杆菌；具体为取上述扩大培养的菌液30ul送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为16s引物，其序列为27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: 1)；1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID N0:2);将测序所得序列在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比对，或者将所得序列翻译为蛋白序列后在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比对，最后得出所测的菌种是黄杆菌； 菌种的保存 将上述扩大培养所得菌液进行20%甘油保菌法-80度保藏即可。即将灭菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混匀后即可。本专利技术还提供了ー种鸡病原黄杆菌菌株的疫苗，可以是灭活疫苗。本专利技术所述疫苗的制备方法是 接种将权利要求I所述鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织ー小块放于装有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种； 灭活病菌液将上述制成的生产用菌种中加入甲醛溶液，边加边充分摇匀，置摇床灭活，作为制苗用抗原液； 乳化制备疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后灭菌，之后将灭菌的吐温-80加到水相之中，占1%，将上述佐剂加上同样体积的制苗用抗原液后进行乳化，充分振摇使吐温完全溶解；在乳化終止前加入防腐剂；防腐剂为I %硫柳汞，加入量占疫苗总体积的1%，最終浓度为万分之一； 分装将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，4°C保存即可。制备方法还包括检测是否完全灭活的步骤。在确保完全灭活病菌的同时尽量減少甲醛使用量，对病菌抗原液在不同甲醛灭活终浓度(0.1^.0.2^.0.3^^0 0.4%)及灭活时间(3h、6h、12h、24h和48h)进行了多次交叉重复实验。研究结果表明甲醛终浓度为0.4%，灭活时间为48h，灭活效果最佳。检测是否完全灭活的方法可为取灭活的菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB平板涂布，37°C培养72小时，平板上是否长菌；同时取灭活菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB液体培养基中，37°C培养72小时，液体培养基是否长菌；以上两点均没有长菌，则说明菌液已经完全灭活。本专利技术还提供按照上述制备方法制备所得的疫苗。本专利技术的制备方法具有如下优点方法简单，效果良好，经过多批次的动物实验和田间试验，结果表明疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后I个月测HI抗体水平，几何平均滴度ND为9. 8 10. 51og2。鸡群生长状况良好，开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫对照组降低0. 6% 2. 5%。上述制备方法制备的灭活疫苗质量确实、可靠，符合要求。本专利技术制备的疫苗可用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病，达到预防疾病的效果。临床实验的结果表明本专利技术的疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后I个月测HI抗体水平，几何平均滴度黄杆菌为9. 8 10. 51og2。鸡群开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫四联苗对照组降低0. 6% 2. 5%，平均每只鸡多产蛋2 6枚。免疫后鸡群可产生较高的抗体水平，維持期较长，对强菌攻击具有较好的保护效果。本专利技术通过小试、实验室工作、エ艺探索等具体工作，结合实验室研究多批次试制产品和5个批次的エ业化流水生产线中试生产，经过多批次的动物实验和田间试验，获得了大量的实验数据，实验结果的符合对比均证实，研制的“鸡黄杆菌灭活疫苗”质量确实、可靠，符合要求。具体实施例方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :菌种分离方法和标准 I、囷种制备 (1)菌种的分离 取发生传染性肝炎的病鸡(福建厦门翔安内盾养鸡场)肝部组织ー小块(约50mg)放于装有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分别含有氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布(氨苄0. 05mg/ml;卡纳0. 04mg/ml)，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长； (2)菌种扩大培养 从上述长菌的平板中挑单菌落到同时含有氨苄和卡纳的250ml LB液体培养基中(氨苄:0. 05mg/ml;卡纳0. 04mg/ml )，37°C摇床培养 24-30 小时，测 OD600 约为 2. 0; (3)菌种鉴定 取上述扩大培养的菌液30ul送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为16s引物，其序列为 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: I) ；1492R :GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO: I);将测序所得序列在 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi)上比对,或者将所得序列翻译为蛋白序列后在NCBI (http://blast. n本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种鸡病原黄杆菌菌株，保藏号为CCTCC M 2012100。2.—种制备权利要求I所述的鸡病原黄杆菌菌株的方法，其特征在于， 菌种的分离取发生传染性肝炎的病鸡肝部组织ー小块放于装有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取一定量于分别含有不同抗生素氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布，37°C培养24h ;结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长； 菌种扩大培养从上述长菌的平板中挑单菌落到含抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床培养24-30小时； 菌种鉴定取上述扩大培养的菌液测序，得出所测的菌种是黄杆菌； 所述菌种扩大培养中所述的抗生素为同时含有氨苄和卡纳，测序所用引物为16s引物，序列分别为AGAGITTGATCCTGGCTCA 和 GGTTACCTTGTTACGACTT。3.ー种含有权利要求I所述鸡病原黄杆菌菌株的疫苗。4.权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是灭活疫苗。5.权利要求3所述的疫苗用于预防鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的用途。6.ー种利用权利要求I所述的菌株制备权利要求4所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈建明，陈敏，杨慧，胡彬，翁勤，
申请(专利权)人：厦门安特奥生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。