本发明专利技术涉及一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒。肠出血性大肠杆菌EHEC为出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体。引起人类疾病的主要是O157：H7血清型。现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明专利技术提供了特异性检测肠出血性大肠杆菌EHEC的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合肠出血性大肠杆菌EHEC的适配子，所述适配子为单链DNA。本发明专利技术试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，EHEC分为157、111等血清型，主要致病菌株为0157:H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。2011年5月，德国爆发肠出血性大肠杆菌病。据罗伯特·科赫研究所6月观日公布的最新疫情通报，德国一个多月来肠出血性大肠杆菌感染病例累计达3901例，截至27日，死亡患者已达47人。报告还指出，本次德国疫情与以往产志贺毒素大肠杆菌造成的疫情不同，其特点为：一、感染病例中溶血性尿毒综合征重症病例所占比例达25％，远高于以往疫情；二、溶血性尿毒综合征病例中成人患者约占89％，且多数是女性。而以往产志贺毒素大肠杆菌感染者多数是儿童，且没有明显性别差异；三、以往疫情致病菌大多数是血清型0157型大肠杆菌，这次则是0104型；四、本次感染的潜伏期平均为8天，以往是3到4天。目前，国内外在食品中大肠杆菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象各有不同而各具优缺点。传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。通过指数富集配体的系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
技术实现思路
本专利技术公开了一种高特异高敏感检测肠出血性大肠杆菌EHEC的方法，提高了它的检测和诊断效率。为了解决现有大肠氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本专利技术提供一种特异识别肠出血性大肠杆菌EHEC的试剂盒及其应用。上述试剂盒，适配子可以采用生物素标记。本专利技术中，所述的核酸适配体能够特异结合肠出血性大肠杆菌。本专利技术另外提供一种肠出血性大肠杆菌EHEC适配子的筛选方法。随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。随机单链DNA文库：5’-TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3’(注：n35代表35个A、T、C、G碱基中任意一种的35个集合)。引物Ⅰ：5’–TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3’引物Ⅱ：5’-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3’引物Ⅲ:5’-地高辛–TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3’引物Ⅳ：5’-生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3’。2.SELEX筛选获得肠出血性大肠杆菌EHEC特异的寡核苷酸适配子1)SELEX筛选过程：a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA 10μg加入到400ul 1×结合缓冲液，95度变性5min，然后迅速置于冰上10min；b.加入1mL肠出血性大肠杆菌EHEC菌悬液2.0×108,于37℃摇床100rpm结合1.2小时，使单链DNA文库与菌充分作用；c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA，室温下离心10 000rpm离心10min分离未与菌结合的单链DNA文库；d.弃上清，加入600μL 1×冲洗缓冲液，离心10 000rpm离心10min，重复此过程4次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；e.接上步离心后去上清，加入100μL去离子水99℃加热3min，高速离心18 000rpm离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中),-20°C保存备用。2)PCR富集与肠出血性大肠杆菌EHEC特异结合的寡核苷酸适配子：每轮筛选后获得的与肠出血性大肠杆菌EHEC特异结合的寡核苷酸适配子文库通过PCR扩增得到富集；a.以上述上清为模板，通过引物Ⅰ和引物Ⅳ扩增产生一端带生物素标记的双链DNA；b.PCR扩增条件：95℃预变性3min，然后进行30循环95℃变性35s，60℃退火37s，72℃延伸33s，最后72℃延伸10min；c.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作用与链亲合素交联的磁珠结合，经过1×连接(the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涤3次，用100mM的新鲜NaOH 37℃变性30min,使不带生物素的单链DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。3)重复筛选：重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行15轮筛选，其中第6、9轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。特异识别肠出血性大肠杆菌EHEC的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下：EHEC-1:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTAATAAACAATACCTCCCATCCCTCTCCTTTCGACCAAGTGACAGTGACGAGEHEC-2:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTTTACTATCCCCATCATCTTATCATAAACTTTACGACCAAGTGACAGTGACGAGEHEC-3:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTATTAAACCACAAAACACTTTAACCTTCACTAACGACCAAGTGACAGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合肠出血性大肠杆菌的核酸适体。
【技术特征摘要】
1.一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合肠出血性大肠杆菌的核酸适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨国林，
申请(专利权)人：杨国林，
类型：发明
国别省市：北京;11
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