本发明专利技术提供一种肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒，所述的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒包括以stx2基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明专利技术的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种。
技术介绍
2011年5月德国爆发肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染疫情，根据世界卫生组织的报道，截止6月5日，德国已报告630例HUS病例，死亡15例；1601例EHEC感染病例，死亡6 例。此外，欧洲奥地利、捷克、瑞典、丹麦、荷兰、波兰、法国、瑞士、挪威、西班牙、卢森堡和英国等12国共报道31例HUS (死亡1例)和EHEC感染病例73例。美国报道2例HUS病例。肠出血性大肠杆菌感染是一种人畜共患病，主要引起腹部绞痛和轻度腹泻，一些病例为血性腹泻(出血性肠炎)。多数病人10天内康复，少数病人特别是幼儿和老年人，可出现严重并发症，如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症(HUS)。一般5°/Γ Ο%的EHEC感染者可发展为溶血尿毒综合症，病例死亡率为3%至5%。EHEC致病主要依靠分泌毒素来使人体受到损害。EHEC产生的毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素；又因与志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺样毒素(81^8￡1-111 ^0^11，31^)或志贺毒素(计力。志贺毒素在肠道中能够杀伤上皮细胞，并引起严重的炎症反应和广泛的组织病理学损伤，从而导致血痢或无血性腹泻。EHEC是大肠杆菌的一个亚型，0157:H7是EHEC的主要血清型，此外还包括026、 0111、0103、0113、0117、0128等四十多个血清型，此次引起德国EHEC感染疫情的主要为 0104 :H4血清型。鉴于EHEC危害的严重性以及覆盖血清型的广泛性，因此准确、快速检测肠出血性大肠杆菌具有十分重要的意义。传统肠出血性大肠杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的肠出血性大肠杆菌检测试剂盒。本专利技术的目的可以通过以下技术措施实现一种肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒，所述的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒包括以stx 2基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。志贺毒素由原噬菌体所编码，它由A、B 2个亚单位组成，stx-A为RNA- N-糖苷酶(RNA- N- glucosidase)催化亚单位，是毒素的毒力区。stxB为靶受体结合区，可以激发机体的免疫应答，是开发疫苗可选择的重要靶分子。stx可分成2类即stxl和stx2。本专利检测的是stx2基因(GeneBank的gi为25992109)，具有很高的特异性。作为本专利技术肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1) CTTCGTTAAATAGTATACGGACA 外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2) GGCCACATATAAATTATTTTGCT 内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)GTGTGGTTAATAACAGACACCGATGTTTTGAGATATCGACCCCTCTTG 内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)GGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACTTTTATAATCAGACGAAGATGGTCAA 或外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)TGCAAATCAGTCGTCACT外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)CATCGTATACACAGGAGCA内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)TCTGGATGCATCTCTGGTCATTTTTCACTGGTTTCATCATATCTGG内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)AGTTCTGCGTTTTGTCACTGTTTTTTGCCTGACGAAATTCTCTC。作为本专利技术肠出血性大肠杆菌Stx2基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒还包括feiDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。 作为本专利技术肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒的更优选实施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度4-10 U/ μ L ；所述的反应液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 体积％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱；所述的样品预处理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 体积 % Triton X-100 ；所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为肠出血性大肠杆菌基因组DNA ；所述的内引物FIP/BIP各为1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.2 0.25 μmol/L0作为本专利技术肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒的最优选实施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度8 U/ μ L ；所述的反应液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；所述的样品预处理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2体积 % Triton X-100 ；所述的显色液为STOR Green I ；所述的内引物FIP/BIP的浓度为1.6ymol/L ；所述的外引物F3/B3的浓度为0. 2 μ mol/L。作为本专利技术肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种肠出血性大肠杆菌ｓｔｘ２基因检测试剂盒，其特征在于，所述的肠出血性大肠杆菌ｓｔｘ２基因检测试剂盒包括以ｓｔｘ２基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物ＦＩＰ／ＢＩＰ和外引物 Ｆ３／Ｂ３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆晔，田桢干，王传现，章琪，卢钟山，曹以诚，杜正平，陈洵，谭慧媚，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，中华人民共和国上海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：81
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