一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，包括Taq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂；上游引物的核苷酸序列为：5＇

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法。

技术介绍

[0002]镰刀菌病对于海水虾或淡水虾而言，是较为常见的疾病之一，尤其对越冬亲虾有较高的感染率。镰刀菌病病原包括腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)和禾谷镰刀菌(Fusarium carum)等，主要寄生于虾的鳃、头胸甲、附肢体壁和眼球等部位，主要症状为感染部位变黑，例如寄生于鳃部时引起鳃组织坏死变黑，有人称之为“黑鳃病”，但是该症状与由细菌引起的“褐斑病”相似，很难从外观症状进行区分。
[0003]现有的镰刀菌病的检测方法，通常需要从病灶处取样然后借助显微镜等设备去进行检测，这种方法只能是在对虾发病后才进行检测，操作过程繁琐，而且灵敏度低无预警作用。因此，开发出一种可以在虾苗出现镰刀病症状之前即可快速检测到镰刀菌的方法，使养殖户有足够的时间做出相应的应对措施，从而避免虾苗出现镰刀菌病症状，具有十分重大的实际意义。
[0004]PCR技术是生物检测领域较为成熟的技术，且在PCR技术中，荧光定量PCR技术操作步骤较为简易，可以避免扩增产物引起的交叉感染，减少假阳性的发生，因此荧光定量PCR在生物检测领域的应用极为广泛。通常在荧光定量PCR技术中，需采用冻干PCR试剂，而冻干PCR试剂对储存条件苛刻，常需要在较低温度下保存和运输，成本较大。因此，制备一种可以常温下储存和运输的冻干PCR试剂，具有较大的经济意义。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的缺点和不足，本专利技术提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂及应用其检测虾苗镰刀菌的方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
[0006]根据本专利技术的第一个方面，提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，其特征在于：包括Taq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂；
[0007]上游引物的核苷酸序列为：5＇
‑
GTCACGTCGAGCTTCCATAGC
‑
3＇；
[0008]下游引物的核苷酸序列为：5＇
‑
GAAGTTGGGGTTTAACGGCG
‑
3＇；
[0009]荧光标记探针的核苷酸序列为：5＇
‑
TAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGG
‑
3＇。
[0010]优选地，荧光标记探针5＇端标记的荧光报告基团包括FAM，3＇端标记的荧光猝灭基团包括MGB。
[0011]对于虾苗镰刀菌的基因序列进行全面分析后，选择以虾苗镰刀菌5.8SrRNA基因保守序列为靶标，在此基础上设计和优化得到的引物和荧光标记探针具有合适的长度和特定的碱基序列，对镰刀菌有较好的特异性，因而可以利用上述引物和荧光标记探针实现对镰
刀菌的特异性检测。
[0012]优选地，每管冻干PCR试剂包括1
‑
20单位Taq DNA聚合酶、1
‑
20pmol上游引物、1
‑
20pmol下游引物、0.5
‑
10pmol荧光标记探针、质量体积比为2
‑
15％的冻干保护剂。其中，质量体积比为质量浓度，表示每单位体积中的质量是多少，单位为“kg/L”或“kg/m
3”，全文中的其他质量体积比表示的意义与此一致。
[0013]优选地，每管冻干PCR试剂包括7.5单位Taq DNA聚合酶、5pmol上游引物、5pmol下游引物、2.5pmol荧光标记探针、质量体积比为7.2％的冻干保护剂。
[0014]优选地，冻干保护剂包括海藻糖、蔗糖、葡萄糖、岩藻糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖苷、聚乙二醇中的至少一种。
[0015]根据本专利技术提供的第二个方面，提供一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0016](1)通过将Taq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂混合；
[0017](2)将所得到的混合物进行冻干；
[0018]冻干的反应程序为
‑
45℃，2h；
‑
45℃，20Pa，2h；
‑
45℃，10Pa，16h；25℃，10Pa，2h。
[0019]通过选择合适的冻干程序和冻干保护剂，使得由Taq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂制备的冻干PCR试剂可以在常温下储存和运输，且该冻干PCR试剂还可以在高温下保持稳定一段时间，降低了储存和运输等成本。
[0020]根据本专利技术的第三个方面，提供一种检测虾苗镰刀菌的方法，采用上述用于检测镰刀菌的冻干PCR试剂进行检测。
[0021]优选地，上述检测虾苗镰刀菌的方法，包括如下步骤：S1.提取待测虾苗的DNA；S2.利用复溶剂将冻干PCR试剂复溶后，以待测虾苗的DNA为模板，进行PCR扩增；S3.分析PCR扩增产物。
[0022]优选地，复溶液包括以下组分：0.01
‑
0.2μmol镁离子、0.25
‑
2.5μmol三羟甲基氨基甲烷、0.25
‑
5μmol钾离子、0
‑
2％质量体积比的非离子型去污剂。三羟甲基氨基甲烷的英文别称为Tris。
[0023]优选地，复溶液包括以下组分：0.05μmol镁离子、1.25μmol三羟甲基氨基甲烷、2.25μmol钾离子、0.1％质量体积比的非离子型去污剂。
[0024]影响PCR扩增的因素很多，特别是冻干PCR的各物料组成和复溶液的各物料组成都会对PCR扩增产生影响，本方案通过严格控制冻干PCR的物料组成和复溶液的物料组成，使冻干PCR试剂与复溶液相互配合，能够快速、有效地完成PCR扩增。
[0025]优选地，非离子型去污剂包括曲拉通X
‑
100、吐温20、吐温80、NP40中的至少一种。
[0026]优选地，PCR扩增的程序为：55℃，5分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒钟，60℃，25秒钟，40个循环；PCR扩增完成的时间不超过60分钟。
[0027]综上，本专利技术通过利用镰刀菌5.8S rRNA基因设计特异的引物和荧光标记探针，并将引物和荧光标记探针与Taq DNA聚合酶、冻干保护剂一起冻干形成冻干PCR试剂，使得引物和荧光标记探针经过冻干后，比较稳定，不容易降解，可以常温运输和保存，适于野外使用，且减少运输和保存成本。另外，本专利技术利用该冻干PCR试剂应用于虾苗镰刀菌的检测中，该检测方法可以检测极低含量的镰刀菌，因此可以在虾苗出现镰刀菌病症状之前就可检测到镰刀菌，使养殖户可以根据检测结果做出相应的处理措施，避免虾苗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，其特征在于，包括Taq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、荧光标记探针、冻干保护剂；所述上游引物的核苷酸序列为：5＇
‑
GTCACGTCGAGCTTCCATAGC
‑
3＇；所述下游引物的核苷酸序列为：5＇
‑
GAAGTTGGGGTTTAACGGCG
‑
3＇；所述荧光标记探针的核苷酸序列为：5＇
‑
TAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGG
‑
3＇。2.如权利要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，其特征在于：所述荧光标记探针5＇端标记的荧光报告基团包括FAM，所述3＇端标记的荧光猝灭基团包括MGB。3.如权利要求1所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，其特征在于：每管冻干PCR试剂包括1
‑
20单位所述Taq DNA聚合酶、1
‑
20pmol所述上游引物、1
‑
20pmol所述下游引物、0.5
‑
10pmol所述荧光标记探针、质量体积比为2
‑
15％的所述冻干保护剂。4.如权利要求4所述用于检测虾苗镰刀菌的冻干PCR试剂，其特征在于：每管冻干PCR试剂包括7.5单位所述Taq DNA聚合酶、5pmol所述上游引物、5pmol所述下游引物、2.5pmol所述荧光标记探针、质量体积比为7.2％的所述冻干保护剂。5.如权利要求1所述用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊槐，肖周婷，马春平，卢桂冰，王国权，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：