结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，所述的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明专利技术的结核分枝杆菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种。
技术介绍
以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在 一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染 和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real timePCR)技术虽然较 好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此 不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较 高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定 性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技 术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已 建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。对于结核分枝杆菌的快速检测技术也有一定的研究，例如中国ZL200810028441. 7 号专利技术专利“基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方 法”。该专利针对结核分枝杆菌的重复性因子插入序列6110进行检测。重复性因子插入序 列是一段能在染色体上进行转座的遗传因子，一般在染色体上存在多个拷贝，如6110是在 中发现的插入序列，该因子的长度为1361，是一功能性转座因子，其序列与肠杆菌科的3家 族有同源性。选择6110上不同寡核苷酸作为引物进行扩增，发现只有群内有扩增带，且不 同种其拷贝数也不同，在人型结核杆菌中有10 20个拷贝。牛型分枝杆菌中只有1个拷 贝，田鼠分枝杆菌中有10 20个拷贝。高拷贝数的靶序列有利于提高扩增反应的灵敏度， 而报道了在越南和东南亚地区分离到的一些人型结核杆菌中缺乏该因子。因此，以重复性 因子插入序列6110作为广泛的结核分枝杆菌诊断靶序列，有可能使得其结果有漏检。因此，需要一种检测效果更全面、漏检率低的结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用 方法以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、漏检率 低的结核分枝杆菌检测试剂盒。本专利技术的目的可以通过以下技术措施实现一种结核分枝杆菌检测试剂盒，所述 的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的gyrB基因为靶基因、基于环介 导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。单拷贝的gyrB是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因进化速 率快，每100万年的平均碱基替换率为0. % 0. 8%。该区段基因能对假单胞菌、芽孢杆5菌、弧菌、肠杆菌、分枝杆菌、气单胞菌、乳酸菌等不同属或科内的近缘种进行区分鉴定，还 可通过设计种特异性引物进行定量PCR或者限制性片段分析。本专利技术针对结核分枝杆菌复 合群的gyrB(即DNA促旋酶的B亚单位蛋白，其在NCBI上的编号为GQ247736. 1)基因设 计引物，由于该基因高度保守并广泛存在于各结核分枝杆菌菌种中，因此其引物能够扩增 并检测出结核分枝杆菌复合群所有菌种，包括M. tuberculosis, Μ. microti, Μ. africanum, Μ. bovis0作为本专利技术结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物F3: (SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3 (SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP: (SEQ ID NO 3)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAttttGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP:(SEQ ID NO 4)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCttttTAACTTTGTGCGGTGCAGTG或外引物F3， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP， (SEQ ID NO 7)ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP， (SEQ ID NO 8)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG ；或外引物F3”(SEQ ID NO 1)ACCACGGAATACGACTTCGA外引物B3”(SEQ ID NO 2)AGTGAAAGGTGCGGCTCT内引物 FIP”(SEQ ID NO 9)GGTCACCCTCTCGTCGGTCAGCAAGAGATGGCGTTCCTC内引物 BIP”(SEQ ID NO 10)GAAGTGGTCAGCGACGTCGCTAACTTTGTGCGGTGCAGTG ；或外引物F3”， (SEQ ID NO 5)GGGTACGAGTGGTCTCAGG外引物B3”， (SEQ ID NO 6)CGTCTTGGGTCACCCTCT内引物 FIP”， (SEQ ID NO 11) ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGAGAAGTCGGAACCCCTGG内引物 BIP”， (SEQ ID NO 12)ATACGACTTCGAAACCGTCGCCGGTCAGCCCCTTGTTGAG。作为本专利技术结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的结核分枝杆菌检测 试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、裂解液3、稳定液、反应液、显色液和阳性 对照液。作为本专利技术结核分枝杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的反应液每IL中 含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-ClUO 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫 酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25mL TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；所述的裂解液1 每 IL 中含有 0. 1-0. 2mol NaOH,5 IOmL Triton X-100 ；所述的裂解液2为蛋白酶K ；所述的裂解液3每IL中含有ρΗ7· 5的0. 5-lmol Tris-HCl ；所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为结核分枝杆菌基因组DNA。作为本专利技术结核分枝杆菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的反应液每IL中 含有 2mmol dNTP、25mmol Tris_Cl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、 1. 25mL TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol ；所述的裂解液1 每 IL 中含有 0. Imol pH9. 5 的 NaOH 和 5mL Titon X-100 ；所述的裂解液3每IL中含有Imol pH7. 5的Tris-HCl。作为本专利技术结核分枝杆菌检测试剂盒的优选实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的结核分枝杆菌检测试剂盒包括以结核分枝杆菌复合群的ｇｙｒＢ基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物ＦＩＰ／ＢＩＰ和外引物Ｆ３／Ｂ３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹以诚，赵雁林，杜正平，戴广明，谭慧媚，陈洵，田文武，冯雪梅，柯佳佳，尹斌，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81