通过法夫酵母生产角黄素制造技术

本发明专利技术公开了一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括在需氧条件下，在水溶液营养培养基中培养一种来源于Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（法夫酵母）属的、表达β－胡萝卜素酮酶基因的重组微生物，并从所述的重组微生物细胞中或从培养基中分离得到类胡萝卜素。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及叶黄素类胡萝卜素的生产，尤其涉及通过法夫酵母(Phaffia)属的微生物来生产角黄素和海胆烯酮。更特别的，本专利技术提供了一种生产叶黄素类胡萝卜素的方法，尤其是通过遗传修饰的法夫酵母属的重组微生物来生产角黄素和海胆烯酮的方法。采用本专利技术的方法，可以在法夫酵母属的重组微生物中生产除了虾青素之外的其他有用的叶黄素类胡萝卜素，如作为主要叶黄素类胡萝卜素的角黄素和海胆烯酮。任何能生产β-胡萝卜素的菌株都可作为合适的宿主菌株。当选择的宿主菌株是能从β-胡萝卜素中生产虾青素的常规法夫酵母菌株时，在编码β-胡萝卜素酮酶的基因被导入和表达后，可产生虾青素和其他叶黄素类胡萝卜素的混合物。另一方面，当不能产生虾青素和可积累β-胡萝卜素的菌株被选择作为所述的宿主菌株时，可以预期产生最高水平的叶黄素类胡萝卜素如角黄素和海胆烯酮，并且无虾青素的积累。可通过诱变累积虾青素的红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)获得累积β-胡萝卜素的宿主菌株。可选的，还可通过失活虾青素合成酶来获得累积β-胡萝卜素的宿主菌株，虾青素合成酶是一种涉及从β-胡萝卜素中合成虾青素的生物合成过程的酶，其公开于美国专利US 6,365,386中。虾青素合成酶基因的破坏是酶失活最常规的方法之一。此外，还可通过公共典型培养物保存中心获得这类累积β-胡萝卜素的宿主菌株。例如，可从美国典型培养物保存中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)购买累积β-胡萝卜素的红法夫酵母P.rhodozyma ATCC96815菌株。分离一种新的β-胡萝卜素累积红法夫酵母菌株，它可以是从自然环境中产生虾青素基因的菌株之衍生物或自发突变体，这将是制备本专利技术宿主菌株的另一种途径。一方面，本专利技术涉及一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括培养表达β-胡萝卜素酮酶的重组法夫酵母菌株。所述的β-胡萝卜素酮酶催化β-胡萝卜素中的β-紫罗兰酮环上的4和4′位置上的亚甲基转化为酮基基团，从而经海胆烯酮产生叶黄素、角黄素。已从许多物种中分离得到编码该酶的基因，例如从海洋细菌中分离的crtW(橙黄琼脂杆菌(Agrobacterium aurantiacum)和产碱菌属(Alcaligenessp.))，从Paracoccus marcusii中分离的crtW(GenBank登记号No.Y15112)，从Paracoccus carotinifaciens sp.nov.中分离的crtW，和从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中分离的bkt基因(GenBank登记号No.D45881)。在本专利技术中，编码具有β-胡萝卜素酮酶活性的蛋白的任何基因均可采用。优选的，所述β-胡萝卜素酮酶基因可从选自如下属微生物组的微生物中获得土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱菌属、副球菌属(Paracoccus)、和具有β-胡萝卜素酮酶基因的红球藻(Haematococcus)。更优选，所述β-胡萝卜素酮酶基因可从选自如下组的微生物中获得橙黄琼脂杆菌(GenBank登记号No.D58420)、产碱菌PC-1(GenBank登记号No.D58422)、Paracoccus marcusii MH1(GenBank登记号No.Y15112)、格兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)(日本专利JP-A昭和10-155497的说明书中记载了来源于该微生物的β-胡萝卜素酮酶基因的DNA序列)、和携带β-胡萝卜素酮酶基因的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)(GenBank登记号No.D45881)，其中GenBank登记号表示来源于不同微生物的各自的β-胡萝卜素酮酶基因的DNA序列。更优选，所述的β-胡萝卜素酮酶基因可来源于产碱菌PC-1，或者其基本上同源的DNA序列。术语“基本上同源的DNA序列”是指所述编码β-胡萝卜素酮酶的DNA序列为编码氨基酸序列的DNA序列，其中该氨基酸序列与产碱菌PC-1的crtW氨基酸序列相比具有超过60％，优选超过70％，更优选超过80％，和最优选超过90％的同源性，并且该多肽的氨基酸序列与产碱菌PC-1的crtW编码的酶具有相同类型的酶活性。通过利用β-胡萝卜素酮酶基因，可以使法夫酵母属的微生物具有生产角黄素和海胆烯酮的能力。可采用公知的重组技术来制备表达β-胡萝卜素酮酶基因的法夫酵母重组微生物。用于分离和克隆编码本专利技术β-胡萝卜素酮酶DNA的技术为本领域的常规技术，其包括从基因组DNA中的分离。可通过聚合酶链反应(下文中称作PCR)来实现由这种基因组DNA来克隆本专利技术的DNA序列。分离或克隆的编码β-胡萝卜素酮酶的DNA在克隆至适当的表达载体后可优选的用于在宿主微生物法夫酵母中表达所述酶。“表达载体”包括能表达所含的DNA序列的载体，其中所述的序列可操纵的与其他序列，如能影响所述DNA序列在法夫酵母属的微生物中表达的调控序列相连接。术语“可操纵的连接”是指一种并列方式，其中所述的元件间呈以允许其按照其预期的方式行使功能的关系。术语“调控序列”包括，最小程度，是指感兴趣基因表达所需的元件；并且还可包括其他的有用元件。一般而言，调控序列包括启动子、终止子，和在某些情况下包括增强子、反式激活蛋白、或转录因子。组成型启动子，如来源于红法夫酵母(P.rhodozyma)(WO 97/23,633)的甘油醛-3-脱氢酶(GAP)基因启动子可用于实现组成型表达。诱导型启动子还可被用于实现精确调控表达。诱导型启动子的实施例之一为编码热休克蛋白或淀粉酶基因及其类似物的启动子。本领域技术人员公知的方法可被用于构建所述的表达载体。它的含义是，虽然没有清楚的阐述，即所述表达载体必须以游离基因的方式或作为整合至染色体DNA的一部分的方式在宿主有机体中进行复制。通常，在后一种情况下可以预计所述基因具有更高的稳定性。为了通过同源重组的方式将表达载体整合至宿主微生物染色体上，制备含有与宿主基因组DNA同源的DNA片段的至少一部分的载体。基于此，在法夫酵母属的微生物中可有效的采用rDNA基因片段。所述的rDNA为一种在基因组中以多拷贝方式存在的卫星DNAs。通过采用rDNA片段作为表达载体上的靶DNA，所述载体上的待表达目的DNA可被整合至宿主基因组上，并且也可以多拷贝的形式存在。这可提高基因用量效果，从而有助于目标酶的超表达。在本专利技术实施例中，所述的rDNA片段可以方便的用于该目的。本专利技术试图包括那些具有等效功能，并在以后公开的其他形式的表达载体。可采用各种方式来操纵编码β-胡萝卜素酮酶的分离的DNA序列以实现多肽表达。根据表达载体的需要，在插入表达载体之前，可取的或必须的可对编码所述β-胡萝卜素酮酶的核酸序列进行操作。修饰用于克隆方法的核酸序列的技术是本领域已知的。克隆于表达载体中的含有所述β-胡萝卜素酮酶的重组DNA可被导入宿主微生物中。将外源DNA导入真菌细胞(包括法夫酵母属的微生物)中的方法是本领域公知的。其包括，例如，通过LiCl方法转化，原生质体融合，电穿孔，通过采用DNAs包裹的粒子进行轰击的粒子枪方法。在本专利技术的实施例中，采用粒子枪方法作为红法夫酵母的转化方法。本领域技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产角黄素和海胆烯酮的方法，其包括在需氧条件下，在含水营养培养基中培养Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（法夫酵母Ｐｈａｆｆｉａ）属的表达β－胡萝卜素酮酶基因的重组微生物，并从所述重组微生物细胞或从液体培养物中分离得到的类胡萝卜素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，尾岛和之，濑户口丰，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]