本发明专利技术涉及在缺乏二肽基氨肽酶（DAP）活性的酵母细胞系中、尤其是巴斯德毕赤酵母中产生治疗性蛋白的方法和组合物。DAP活性已通过基因修饰巴斯德毕赤酵母细胞系使得STE13和DAP2缺失而去除。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在无ニ肽基氨基肽酶(DAP)活性的酵母细胞系中产生糖蛋白的方法和组合物，该糖蛋白用作人或动物的治疗剂。
技术介绍
酵母是重要的制备重组蛋白的生产平台。由于酵母是真核生物，它们和更高等真核生物具有共同的进化过程，包括许多存在于分泌途径中的翻译后修饰过程。糖工程学中的最新进展产生了具有遗传修饰的糖基化途径(允许酵母进行一系列酶促反应)的酵母菌株 细胞株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞系,其模拟了人类中的糖蛋白的加工，见例如，US Pat. Nos. 7，029，872和7，326，681，其中描述了在与其人类对应物基本相同的较低等真核宿主细胞中产生重组糖蛋白的方法。如前述方法在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中产生的人样唾液酸化双触角复合物N-连接聚糖已经显示了产生治疗性糖蛋白的用途。和更高等真核生物相似，酵母也表达许多蛋白酶，其中许多或定位于分泌途径、或通过其传递至它们的最終目的地。结果，一些重组蛋白的不期望的蛋白水解作用与依赖于參与的蛋白酶的种类的特异性切割同时发生。ニ肽基氨肽酶(DAPs)是ー类从蛋白的N-末端去除两个氨基酸肽的蛋白水解酶。在酿酒酵母中(Saccharomyces cerevisiae),已经鉴定了具有DAP活性的酶STE13和DAP2的基因，见Julius等人仏11 32 :839- 852,1983 ；Rendueles 等人，T. Bacteriology, 169 :4041-4048,1987。申请人在本专利技术中开发了用于去除巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中DAP活性的方法,其允许产生全长的治疗性蛋白。专利技术概述 在一个实施方式中，本专利技术是用于在缺乏ニ肽基氨肽酶(DAP)活性的酵母细胞系中产生治疗性蛋白的方法。该实施方式包括用编码治疗性蛋白的多核苷酸转化其中DAP活性已经被去除的基因修饰的巴斯德毕赤酵母细胞系、并培养已转化的宿主细胞以产生治疗性蛋白。可以通过修饰巴斯德毕赤酵母细胞系而使STE13、DAP2和DPPIII删除或破坏而去除DAP活性。在另ー个实施方式中，通过修饰巴斯德毕赤酵母细胞系而使STE13和DAP2删除或破坏而去除DAP活性。在一个实施方式中，本专利技术是可用于产生治疗性蛋白的缺乏DAP活性的基因修饰的酵母细胞系，包括通过删除STE13和DAP2而重组修饰的巴斯德毕赤酵母细胞系。在另ー个实施方式中，本专利技术是用于从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)产生治疗性蛋白(如TNFRII-Fc，ー种包含融合至IgGl Fe结构域的肿瘤坏死因子受体2(TNFRII)的胞外结构域的重组融合蛋白(TNFRII-Fc)，或包含GCSF的分泌血浆形式的重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)多肽)的方法。附图简要说明 图I是本专利技术方法中所用载体的示意图。Ura5标记的PpSTE13和PpDAP2敲除载体在图IA和IB中分别表示为pGLY4520和pGLY4521。PpSTE13和PpDAP2诺尔丝菌素标记的载体在图IC和ID中分别表示为pGLY5018和pGLY5019。用于切除转化中所用的敲除片段的SfiI限制性酶切位点下面划线表示。PpSTE13和PpDAP2侧翼区用黒色突出。图2是与酵母中DAP活性相关的TNFRII-Fc的N-末端切割的图示。图2A显示完整的分泌的TNFRII-Fc (SEQ ID NO :3)的7个N-末端氨基酸(SEQ ID勵1)，图28显示截短产物的5个N-末端氨基酸(SEQ ID NO 2)0箭头表示被ニ肽基氨肽酶Dap2p和Stel3p都识别的切割位点。图3是融合蛋白TNFRII-Fc的氨基酸序列，包含肿瘤坏死因子受体2 (TNFRII)和IgGl Fe 区(Fe) (SEQ ID NO :3)。图4是与酵母中DAP活性相关的GCSF的N-末端切割的图示。图4A显示完整的分泌的GCSF (SEQ ID NO :6)的7个N-末端氨基酸(SEQ ID NO :4)，图4B显示截短产物的5个N-末端氨基酸(SEQ ID N0:5)。箭头表示被ニ肽基氨肽酶Dap2p和Stel3p都识别的切割位点。图5是重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。图6是巴斯德毕赤酵母菌株中产生的GCSF的Western印迹的图示，菌株中或STE13或DAP2基因被删除或破坏，即与Stel3p和Dap2活性被去除的巴斯德毕赤酵母菌株中产生的完整更高分子量的GCSF相比(第32-34道)，由于DAP切割而导致的更低分子量的GCSF (第 27-29 道)。图7A-7C表示用于产生STE 13和DAP 2敲除(实施例3)的糖工程菌株YGLY7406的流程图。图7C表示单ー敲除糖工程菌株stel3 (YGLY8084)和dap2 (YGLY8090)以及随后的双敲除菌株(YGLY8096)的流程图。图8A和8B是巴斯德毕赤酵母DAP2的cDNA (SEQ ID NO 37)和氨基酸(SEQ IDNO 38)序列。ORF用黑体字显示，+/-约I kb侧翼序列。图9A和9B是巴斯德毕赤酵母STE13的cDNA (SEQ ID NO 39)和氨基酸(SEQ IDNO 40)序列。ORF用黑体字显示，+/-约I kb侧翼序列。图IOA和IOB是分别扩增用于产生pGLY4511和pGLY4512的PpSTE13的5’ (SEQID N0:41)和 3，(SEQ ID NO :42) DNA 侧翼区。侧翼区(下划线)本身侧翼为构成PpSTE13 5’侧翼区的EcoRI限制性酶切位点的核苷酸或构成PPSTE13 3’侧翼区的HindIIII限制性酶切位点的核苷酸。图IlA和IlB是分别扩增用于产生PGLY4513和pGLY4514的PpDAP2的5’ (SEQID N0:43)和3’ (SEQ ID NO :44) DNA侧翼区。侧翼区(下划线)本身侧翼为构成PpDAP25’侧翼区的EcoRI限制性酶切位点的核苷酸或构成PpDAP2 3’侧翼区的HindIIII限制性酶切位点的核苷酸。附图说明图12是从pAG25扩增的诺尔丝菌素标记盒的cDNA序列(SEQ ID NO :45)，ORF用黑体字显示。图13是巴斯德毕赤酵母DPP III的cDNA (SEQ ID NO :54)序列，ORF用黑体字显示，+/-约I kb侧翼序列。专利技术的详细说明 紅本专利技术所用的术语“ニ肽基氨肽酶活性”或“DAP活性”是指由名为STE13、DAP2或DPPIII的基因产生的多肽的酶切割。本专利技术所用的术语“ニ肽基氨肽酶活性的去除”或“DAP活性的去除”是指由名为STE13、DAP2和DPPIII的基因产生的酶活性的缺失。本专利技术所用的术语“治疗性蛋白”是指可被用于在动物或人类中治疗性地治疗疾病或状况的全长、即非截短形式的生物活性多肽。本专利技术所用的该术语的例子是包含肿瘤坏死因子受体2 (TNFRII)和IgGl的Fe区(Fe)的融合蛋白TNFRII-Fc以及重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)蛋白。本专利技术所用的术语“N-末端识别位点”是指具有基序X-Pro或X-Ala的N-末端序列的多肽，其中X本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.30 US 61/2563691.ー种在酵母宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其中所述宿主酵母细胞缺乏ニ肽基氨肽酶(DAP)活性，所述方法包括a.用编码蛋白的多核苷酸载体转化其中DAP活性已经被去除的基因修饰的酵母细胞；b.在诱导蛋白表达的条件下在培养基中培养被转化的宿主细胞；和c.从转化的宿主细胞或培养基中分离蛋白。2.权利要求I的方法，其中酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。3.权利要求I或2的方法，其中通过从酵母细胞基因组中删除或破坏STE13和DAP2基因而去除DAP活性。4.权利要求I的酵母，其中宿主细胞已经被基因工程化以产生包含人样N-聚糖的糖蛋白。5.权利要求4的酵母，其中人样N-聚糖选自杂合和复合的N-聚糖。6.权利要求I的酵母，其中宿主细胞被基因工程化以产生主要具有N-聚糖的糖蛋白，所述 N-聚糖选自 Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGl cNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2,GlcNAcMan3GlcNAc2,GlcNAc G_4)Man3GlcNAc2、Gal(H)GlcNAc α_4)Man3GlcNAc2 和 NANA Q_4)Gal (1_4)GlcNAc (卜4)Man3GlcNAc2。7.权利要求I的方法，其中酵母进ー步表达人糖蛋白。8.—种缺乏ニ肽基氨肽酶(DAP)活性的基因修饰的酵母细胞，包括其中编码STE13和DAP2的基因组DNA已被从酵母细胞基因组中删除或破坏的酵母细胞系。9.权利要求8的酵母细胞，其中酵母细胞是巴斯德毕赤酵母。10.权利要求6的方法，其中宿主细胞已被基因工程化以产生包含人样N-聚糖的糖蛋白。11.权利要求10的方法，其中人样N-聚糖选自杂合和复合的N-聚糖。12.权利要求6的方法，其中宿主细胞被基因工程化以产生主要具有N-聚糖的糖蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：SR哈密尔顿，TA施塔黑姆，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：
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