【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
,特别涉及一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用。
技术介绍
青蒿素是一种有效抗疟疾药物,其众多的衍生物都被世界卫生组织于2002年认定为一线抗疟疾药物。目前,青蒿素的获得方式主要是从植物青蒿中直接提取。青蒿在世界各地均有分布,但绝大数青蒿中青蒿素含量都很低(≤1‰),且提取成本较高。青蒿的生长依赖于天气、土壤、阳光等多种条件因素,且需要花费漫长的时间,无法即时满足市场的需要,这也导致青蒿素相关药物的市场价格摇摆不定。而化学合成法从头合成青蒿素,因青蒿素分子本身结构复杂,导致合成难度高,步骤多,副产物多,成本高,在经济上不可行。基于从植物中提取与化学合成方法获得青蒿素的种种缺陷,通过生物半合成方法获得青蒿素成为最佳的选择,即通过基因工程改造微生物使其生产青蒿素前体青蒿二烯、青蒿酸或二氢青蒿酸等,再通过几步简单的化学合成方法合成青蒿素。其中,构建高产的前体物的工程菌株是该方法的核心步骤。近年来,分子生物学技术、合成生物学技术、DNA合成技术的快速发展,使得向工程菌株中导入多个外源基因,对基因组进行大规模改造变得更加容易和方便,也为实现构建高产青蒿素前体物提供重要技术支持。目前,利用酿酒酵母直接生产二氢青蒿酸的工作很少,只有发掘出AaDBR2基因的PatrickS.Covello在2008年利用酵母合成了二氢青蒿酸产量为15.7mg/L,同时伴有11.8mg/L的青蒿酸。而其他的课题组更多是合成青蒿二烯或是青蒿酸,再通过高效的化学转化合成二氢青蒿酸。因此,急需提供一种高效的生产二氢青蒿酸的酵母菌株及二氢青蒿酸合成方法。专利技术内 ...
【技术保护点】
一种酿酒酵母工程菌株,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌株过表达ERG10、ERG13、tHMG1、ERG8、ERG19、ERG20、ERG12、IDI1、ADS、CYP71AV1、AaCPR1、AaCYB5、AaADH1和AaALDH1基因,敲除了gal80、gal1、gal7和gal10基因。
【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母工程菌株,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌株过表达ERG10、ERG13、tHMG1、ERG8、ERG19、ERG20、ERG12、IDI1、ADS、CYP71AV1、AaCPR1、AaCYB5、AaADH1和AaALDH1基因,敲除了gal80、gal1、gal7和gal10基因。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌株的基因型为:gal1,7,10Δ::Pgal3-AaCPR1-CYC1t_NATR;leu2Δ::G418R_Pgal7-AaCYB5-CYC1t_ERG19-Pgal1,10-ERG8;ade1Δ::tHMG1-Pgal1,10-IDI1_ADE1;his3Δ::His3_Pgal7-AaALDH1-TDH1t_ERG12-Pgal1,10-ERG10;ura3Δ::tHMG1-Pgal1,10-ERG13;trp1Δ::tHMG1-Pgal1,10-ERG20_TPR1;gal80Δ::URA3_Pgal7-AaADH1-TDH1t;pRS425_Pgal7-AaDBR2-CYC1t_ADH1t-CYP71AV1-Pgal1,10-ADS-PGK1t。3.如权利要求1或2所述酿酒酵母工程菌株的构建方法,其特征在于,包括:将基因片段tHMG1、Pgal1,10、IDI1连接,获得模块A;将基因片段tHMG1、Pgal1,10、ERG13连接,获得模块U;将基因片段tHMG1、Pgal1,10、ERG20连接,获得模块T;将基因片段pAgTEF1、Kan和AgTEF1t连接,获得G418R;将所述G418R、Pgal7、AaCYB5、CYC1t、ERG19、Pgal1,10、ERG8连接,获得模块L;将基因片段Gal7up、Pgal3、AaCPR1、CYC1t、NATR、Gal1down连接,获得模块N;将基因片段pAgTEF1、hphA、AgTEF1t连接,获得HPHR;将所述HPHR、Pgal7、AaALDH1、TDH1t、ERG12、Pgal1,10、ERG10连接,获得模块H;将基因片段Gal80up、URA3、Pgal7、AaADH1、TDH1t、Gal80down与载体连接,获得模块G;将基因片段ADH1t、CYP71AV1、Pgal1,10、ADS、PGK1t连接,获得模块1;将基因片段AaDBR2、CYC1t、Pgal7与所述模块1连接,获得模块2;将所述模块A、所述模块U、所述模块N、所述模块T、所述模块L、所述模块H、所述模块G和所述模块2导入酿酒酵母基因组中,获得酿酒酵母工程菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述构建方法中所用筛选标记为URA3标记、TRP1标记、LEU2标记、HIS3标记、KlURA3标记、G418R标记、Ade1标记或NATR标记。5.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述NATR由pAgTEF1、nat1、AgTEF1t基因...
【专利技术属性】
技术研发人员:李霞,曾薄轩,郭睿,肖文海,王颖,刘宏,元英进,
申请(专利权)人:天津大学,
类型:发明
国别省市:天津;12
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