一种热纤梭菌高密度培养的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵工程领域，具体是一种热纤梭菌高密度培养的方法。其特征是以GS-2培养基为初始培养基，通过多元数理统计方法优化发酵培养基，快速高效的提高热纤梭菌的菌体浓度。本发明专利技术的优点在于提供了一种快速获取热纤梭菌大量菌体浓度的发酵培养基，为后续生产转化纤维素为生物乙醇效率特别高的纤维小体做铺垫。本发明专利技术所得热纤梭菌的菌体密度比初始培养基提高6～9倍，瓶装条件下OD600达到8.85，发酵罐中OD600达到12.7。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵工程领域，具体是热纤梭菌高密度培养的方法。
技术介绍
随着全球能源和环境危机的加剧，寻求替代能源已成为许多国家的研究热点，这其中清洁，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，而生物こ醇是最有发展前景的液体生物能源之一，然而目前生物こ醇还主要来自糖类和淀粉发酵，面对世界人ロ的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产酒精的发展将受到诸多限制(王丹，林建强等，2002)。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，反而造成一定的环境污染，比如城市垃圾。所以用纤维素物料生产新型生物燃料，因为具有重大战略意义而引起世界各国的广泛重视(闻志强，姜薇，2010)。但 是木质纤维素由于极其复杂的结构，导致其降解十分困难(Christian Weber & AlexanderFarwick et. al,2010)。嗜热厌氧的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接将纤维素转化为こ醇而吸引了众多研究者的注意力，该菌可从每摩尔葡萄糖对等物中产生出高达Imol的こ醇，有学者研究指出，热纤梭菌是将纤维素直接转化为こ醇的最有效菌之一(Lynd.et al，2002)。研究表明(Lamedr，1984)，热纤梭菌中广泛存在的纤维小体(cellulosome)是其能够直接把纤维素转化为こ醇的关键所在，因为纤维小体具有类似核糖体的大分子结构，能协调、有序、高效地降解纤维素。虽然当前广泛使用的纤维素酶主要由木霉，青酶和曲霉等真菌产生和生产，然而真菌生产的纤维素酶主要是酸性纤维素酶，而细菌和放线菌产生的纤维素酶往往具有耐碱耐热等独特优点，其应用将大有前景。细菌的纤维素酶即以纤维小体的形式存在(黄俊，陈东，黄日波，2011)。热纤梭菌是ー种高温、厌氧、纤维素降解菌，能在60°C下快速生长，并产生大量的纤维小体分解纤维素、半纤维素为纤维ニ糖、木糖、木聚ニ糖等。其本身也能利用分解产生的小分子物质生产こ醇、こ酸、乳酸、CO2和h2。然而热纤梭菌存在こ醇产量低和こ醇耐受性差等突出缺点，強烈抑制了纤维小体的高效表达。同时高能耗的前处理过程和纤维素酶本身高昂的价格极大的制约了纤维素生物质能源的利用，所以如果能有效提高纤维小体的表达水平，将对于降低纤维素酶的成本，以及进一歩降低纤维素生物质的利用成本具有重要意义。热纤梭菌的高密度培养可能是实现该目的的方法之一。高密度发酵是快速获取菌体及其主要代谢物的主要方法，也是商业化生产的前提条件，对于提高发酵エ业中的生产强度，降低生产成本具有重要意义(陈保立，王世立等，2009)，然而热纤梭菌的高密度培养还未见报道，本专利技术将填补此方面的空白。
技术实现思路
本专利技术开发了热纤梭菌高密度培养的エ艺。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现本专利技术以纤维素质生物质ニ糖降解物，如纤维ニ糖或木聚ニ糖为原料，发酵法直接高密度培养，主要包括以下步骤I.发酵种子液的制备。种子液培养基为GS-2 =KH2PO4 I. 5g/L，K2HPO4 (anhydrous) 2. 9g/L,氮源 2. I g/L, MgCl2 6H20 I. Og/L, CaCl2 2H20 150mg/L,FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteine hydrochloride I. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 5. Og/L, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og/L, Yeast extract 6.Og/L, Sodiumcitrate 2H20 3. Og/L配制发酵培养基，初始pH为7. 4。2.高密度发酵培养基配方KH2PO4 I. 2g/L, K2HPO4 (anhydrous) 6. Og/L,氮源5. Og/L, MgCl2 6H20 2. 49g/L, CaCl2 2H20 150mg/L, FeSO4 6H20 I. 25mg/L, Cysteinehydrochloride 2. Og/L, Resazurin 2. Omg/L,碳源 20. Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 12. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L 配制发酵培养基，并灭菌。其中，碳源为纤维素质生物质，氮源为有机或无机氮源；灭菌前调节PH为8.0 ;若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为5 I。3.接种。将培养好的种子液按一定比例接入厌氧瓶或发酵罐中。4.培养。温度60°C，厌氧，罐或瓶压为-0. IMPa 0. IMPa,间歇性或低速搅拌。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7. 0左右。发酵方式可采用分批，补料分批，连续或半连续等。5.经24h_48h后菌体浓度达到最大,瓶装条件下0D_达到8. 85，发酵罐中OD6tltl达到 12. 7。按照以上步骤，热纤梭菌高密度培养是本
的技术人员能够实现的。本专利技术具有显著优势厌氧条件可省去发酵过程中通入氧气或压缩空气所需的昂贵能源消耗；高温发酵不易发生污染，可減少冷却用水，这些都将进一歩降低热纤梭菌高密度培养的生产成本。附图说明无具体实施例方式实施例I :100ml厌氧瓶发酵I.用ImL注射器取100 ii L C. thermocellum JYTOl的甘油管菌种,接种于装有5mL种子培养基的厌氧瓶中，60°C恒温培养，活化菌种。2.将活化好的C. thermocellum JYTOl菌液3mL接种于50mL种子培养基中，60°C，恒温培养箱中培养24小时，得到一级种子液。3.按配方“KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4(anhydrous)6. Og/L, urea 5. Og/L, MgCl2 6H202.49g/L, CaCl2 2H20 135mg/L, FeSO4 6H20 5.Omg/L, Cysteine hydrochloride2.Og/L, Resazurin 2.Omg/L, cellobiose 20.Og/L, Morpholinopropane sulfonicacid (MOPS) 10. Og/L, Yeast extract 10. Og/L, Sodium citrate 2H20 0. 752g/L” 配制发酵培养基，调整初始pH为8. O。分装培养基IOOmL于300ml厌氧瓶中，不断通入氮气排净瓶内空气，并用聚丁酯塞密封，以保证瓶内厌氧环境。115°C，15min湿热灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成IOOX母液于灭菌后加入。4.约24h后菌体浓度达到最大，停止培养获得发酵液中OD6tltl为8. 85.实施例2:5L发酵罐发酵I.按照实施例I所述方法制备C. thermocellum JYTOl 一级种子液200ml,并计算接种量为I : 10，发酵液总体积为2L时各自所需体积。2 按配方“ KH2PO4 I. Og/L, K2HPO4 (anhydrous) 6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热纤梭菌高密度培养的方法，其特征是以GS？2培养基为初始培养基，通过高温，厌氧发酵，在反应器中实现热纤梭菌的高密度培养。主要包括以下步骤：1)菌种热纤梭菌(Clostridium？thermocellum)JYT012)培养基的制备种子液培养基为：KH2PO4？1.5g/L，K2HPO4(anhydrous)2.9g/L，氮源2.1g/L，MgCl2·6H2O？1.0g/L，CaCl2·2H2O？150mg/L，FeSO4·6H2O？1.25mg/L，Cysteine？hydrochloride？1.0g/L，Resazurin？2.0mg/L，碳源5.0g/L，Morpholinopropane？sulfonic？acid(MOPS)10.0g/L，Yeast？extract？6.0g/L，Sodium？citrate·2H2O？3.0g/L配制发酵培养基，初始pH为7.4。高密度发酵培养基配方：KH2PO4？1.2g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，氮源5.0g/L，MgCl2·6H2O？2.49g/L，CaCl2·2H2O？150mg/L，FeSO4·6H2O？1.25mg/L，Cysteine？hydrochloride？2.0g/L，Resazurin？2.0mg/L，碳源20.0g/L，Morpholinopropane？sulfonic？acid(MOPS)10.0g/L，Yeast？extract？12.0g/L，Sodium？citrate·2H2O？0.752g/L配制发酵培养基，并灭菌。灭菌前调节pH为8.0。3)接种将培养好的种子液按1∶20？1∶60(V∶V)比例接入厌氧瓶或发酵罐中。4)培养温度50？70℃，厌氧，罐或瓶压为？0.1MPa～0.1MPa，搅拌转速为60？100rpm。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH为6.0？8.0。培养时间为12h？48h。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，朱新术，张华仁，张景涛，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：