减毒的革兰氏阴性细菌制造技术

本发明专利技术公开并要求保护革兰氏阴性细菌的突变体，其中所述细菌在核苷酸序列中具有至少一处突变，且由所述核苷酸序列编码的多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性：SEQID?NO：2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列，所述突变导致细菌的毒力减弱。本发明专利技术还公开并要求保护包含这种突变体的免疫原性组合物和疫苗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及活的减毒革兰氏阴性细菌。减毒的革兰氏阴性细菌可用于免疫原性组合物或疫苗组合物中，如用于预防细菌感染，以及用于研究，因为减毒菌株为研究人员和可能的接触者(如动物、人)提供了较高的安全性。因此，本专利技术涉及包含本专利技术革兰氏阴性细菌如活的减毒革兰氏阴性细菌的免疫原性或疫苗组合物。组合物中的细菌也可以是灭活的；但是活的减毒革兰氏阴性细菌可能是有利的。因此，本专利技术还涉及用于制备和/或配制这些组合物的方法；如在合适的培养基上/中培养或培育或繁殖细菌，收获细菌，任选灭活细菌，并与合适的兽医学或制药学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质(vehicle)和/或佐剂和/或稳定剂混合；或者，将细菌与合适的兽医学或制药学可接受载体、赋形剂、稀释剂、或介质和/或佐剂和/或稳定剂混合。由此，本专利技术还涉及细菌在配制这些组合物中的用途。减毒细菌还可作为表达或复制载体，如用于对减毒细菌而言异源的核酸分子的复制和/或表达，所述核酸分子如编码病原体的免疫原、抗原、或表位的核酸分子，病原体的例子是减毒细菌以外的病原体。减毒细菌作为载体的用途也为操作减毒细菌的研究人员或技术人员和可能的接触者(如动物、人)提供了较高的安全性。因此，本专利技术还涉及用于制备这些载体的方法，如转化细菌使得细菌包含且任选表达异源核酸分子。本专利技术还涉及这些载体的用途；如用于生成对细菌而言异源的基因产物，如多肽，诸如免疫原、表位、或抗原的方法，包括培养、培育、或繁殖经转化而包含并在适于表达的条件下表达编码该基因产物的异源核酸分子的细菌，且任选收获或分离或分开基因产物；或者，由经转化而表达它的细菌收获或分离或分开基因产物；或者，用于引发针对基因产物和/或细菌的免疫学应答或免疫原性应答或者针对衍生或获得基因产物的病原体和/或该细菌的保护性免疫应答的方法，包括对受试者施用经转化而表达基因产物的细菌，所述受试者如动物，诸如易受病原体和/或细菌感染的动物，例如牛或火鸡；或者，用于制备免疫原性、免疫学、或疫苗组合物的方法，包括将载体或经转化细菌与制药学或兽医学可接受载体、稀释剂、介质、或赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂混合。本专利技术还涉及用于细菌减毒的靶标，如编码细菌减毒靶标的突变型核苷酸序列或基因，以及用于确立细菌减毒靶标多肽的方法和生成减毒细菌的方法。减毒的靶标可以用作免疫原性化合物，如用在免疫原性组合物或疫苗组合物中，或者用于生成免疫原性或疫苗组合物中所使用的表位。由此，本专利技术涉及减毒靶标在制备组合物中的用途，如与制药学或兽医学可接受载体、稀释剂、赋形剂、或介质和/或佐剂和/或稳定剂混合。本专利技术还涉及用于在受试者，如动物，诸如易受革兰氏阴性细菌诸如巴斯德氏菌感染的动物，如火鸡或牛中诱发免疫学或免疫原性或保护性免疫应答的方法，包括对动物施用本专利技术的疫苗或免疫原性组合物。本专利技术甚至还涉及这些减毒细菌的制备，如革兰氏阴性细菌，诸如巴斯德氏菌；例如，包括将ー种或多种转座元件导入细菌，井分离包含在目标物种中不引起死亡的(且因而是减毒的)转座元件的细菌。任选的是，还可以鉴定细菌中的突变，从而能够获得生成减毒细菌的候选方法。本专利技术甚至还涉及用于生成减毒细菌的这些候选方法。因为已经鉴定或表征了突变，所以可以通过除了将ー种或多种转座元件导入细菌以外的技术将突变导入细菌，诸如 通过同源重组，如导致细菌基因组的一部分发生至少ー个添加(插入)或缺失(还设想了两个或多个添加和/或缺失)或替代(诸如至少ー个核苷酸被另ー种核苷酸替代)的同源重组。因此，本专利技术涉及用于生成包含已知或先前鉴定的修饰或突变(如本文鉴定的修饰或突变)的减毒细菌的方法，包括将缺失或插入或替代导入细菌基因组，通过重组是有利的，并任选鉴定和/或分离包含修饰或突变的细菌。由此，本专利技术还涉及革兰氏阴性细菌突变体，其中所述细菌在如下核苷酸序列中具有至少ー个突变，由所述核苷酸序列编码的多肽与由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性=SEQID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列；所述突变导致细菌的毒カ减弱。而且，本专利技术还涉及本文所述这种细菌的用途、组合物、和方法。
技术介绍
已经公认，活的减毒微生物可以作为高度有效的疫苗；与由不进行复制的免疫原产生的免疫应答相比，由这种疫苗引发的免疫应答常常强度更大且时间更长。对此的ー种解释是活的减毒菌株在宿主中建立了受限感染并模拟天然感染的早期阶段。另外，与杀死的或灭活的制剂不同，活的疫苗能够诱发由细胞介导的有力应答，这可能与它们在抗原呈递细胞诸如巨曬细胞中的复制能力有关。在动物和人类中使用活的减毒疫苗已经有很长的历史，特别是使用化学诱变技木。然而，凭借经验减毒的疫苗能够恢复毒力。结合关于细菌发病机理的日益増加的知识，现代分子生物学技术鉴定了涉及微生物在体内生长和存活的数种基因。这为减毒提供了新的靶基因，而且提出了这样的概念，即可以通过将限定的非恢复突变导入已知涉及毒力的选定基因而将未来的疫苗菌株“合理地”减毒，參阅例如 TO-A-00/61724、TO-A-00/68216、和 EP-A-0889120。尽管已经在实验室中生成了许多减毒菌株，然而只有少数有资格作为潜在疫苗候选者用于动物。这可能是部分由于需要平衡疫苗的免疫原性与微生物恢复活性和致病性的可能性。显然，为减毒选择适当基因(这将生成合适的疫苗候选者)并不简单，而且难以预測。许多因素可能影响减毒突变体作为疫苗的可接受性，因此需要努力研究以鉴定并选择合适的减毒基因。只是在体外进行了许多减毒实验，而且它们的结果不能外推至体内，特别是关于由此生成的突变体对接种动物的残余致病性。參考Kachlany SC、Planet PJ、Bhattacharjee MK、Kollia E、DeSalle R、Fine DH、Figurski DH, Nonspecific adherence by Actmobacillus actinomycetemcomitansrequires genes widespread in bacteria and archaea(伴放线放线杆菌的非特异粘附需要细菌和古细菌中普遍存在的基因)，J BacteriolJOOO年11月，182 (21) :6169_6176。Fuller TE、Martin S、Teel JF、Alaniz GR、Kennedy MJ、Lowery DE, Identification of ActinobaciIIus pleuropneumoniae virulence genes usingsignature-tagged mutagenesis in a swine infection model (猪感染候型中使用标志-标记诱变对大叶性肺炎放线杆菌毒力基因的鉴定)，Microb Pathog, 2000年7月，29(1) :39-51。Fuller TE、 Kennedy MJ^ Lowery DE, Identifica本文档来自技高网...

【技术保护点】
革兰氏阴性细菌突变体，其中所述细菌在核苷酸序列中具有突变，且所述核苷酸序列编码的多肽与由SEQ？ID？NO：75的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，所述突变导致细菌的毒力减弱，其中所述突变是在SEQ？ID？NO：75的第1072？1087位核苷酸之间的插入。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H·R·科鲁克，J·E·施，R·G·费尔德曼，S·G·科特布罗泽，FX·里格罗斯，
申请(专利权)人：梅瑞尔有限责任公司，
类型：发明
国别省市：