一种一菌多酶菌株及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种一菌多酶菌株及其制备方法和应用，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC?NO：M?2011286。本发明专利技术枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)1.1111可产木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9种酶的菌株，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶产量特别高。同时通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种一菌酶菌株，同时还涉及该菌株的筛选方法及应用，属于微生物

技术介绍
酶是一种生物催化剂，饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用的环保型“绿色”饲料添加剂广泛应用于在动物生产中，应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽及水产动物的生产性能，又能减少排泄物中氮、磷含量，保护水体和土壤免受污染， 将有着十分广阔的应用前景。早期的酶制剂以动植物作为原料直接提取，但由于动植物生长周期长，又受地理、 气候和季节等多种因素的影响，不适于大规模的工业生产。目前人们已将目光转向以微生物作为酶制剂的主要来源，如淀粉酶和蛋白酶的微生物制备使用于工业化生产。早期的复合酶制剂是通过单酶复配后再使用，此种方式易造成生产成本过高，质量不稳定，使用不方便。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种一菌多酶菌株。同时，本专利技术的目的还在于提供一种该一菌多酶菌株的筛选方法。进一步地，本专利技术的目的还在于提供一种该菌多酶菌株的应用。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案采用了一种一菌多酶菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) I. 1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO M 2011286。应用经典的细菌鉴定方法及分子生物学方法16S rDNA对其进行鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bac illus subtilis) I. 1111，于2011年8月11日保藏在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO M 2011286。该枯草芽孢杆菌对对胆酸盐、人工胃液、人工肠液等环境表现出很强的耐受能力， 对实验动物安全无毒无副作用，并能产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶多种酶，这有利于该菌株作为益生菌在饲料添加剂中的进一步开发利用， 为进一步研究各酶的性质、各酶之间的相互关系、实现一菌多酶发酵奠定了良好的基础。所述的一菌多酶菌株可产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、 脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶。本专利技术的技术方案还采用了一种一菌多酶菌株的筛选方法，包括以下步骤以产木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶为筛选目标，分别用各酶选择性培养基，根据菌落周围有无透明圈或水解圈，以及透明圈或水解圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值，来初步判断是否为产酶菌株及高产酶活，最终从实验室分离、筛选保存的菌种资源库中筛选到一菌产多酶的菌株。本专利技术的技术方案还涉及一种该一菌多酶菌株在制备益生菌剂方面的应用。斜面和种子培养基以g/L计蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面再加15-20， ρΗ7· 2 ;发酵培养基以 g/L 计玉米粉 36-44，豆饼粉 36-44，Na2HPO4 8，(NH4) 2SO4 4，NH4Cl 0.75，CaCl2 1.0，pH7. O ;培养条件10L发酵罐中发酵体积为7L，接种量为总体积10%， 温度为35-40°C，通气量为3L/L. min，搅拌速度为200-300r/min，发酵时间30_50h，发酵液中有大量的枯草芽孢杆菌活菌、以蛋白酶、甘露葡聚糖酶、淀粉酶和糖化酶为主，同时含有木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶等水解酶，将发酵液浓缩加入 30% -60%淀粉干燥即制成益生菌和复合酶制剂。同时，本专利技术的技术方案还涉及一种一菌多酶菌株在制备饲料方面的应用。复合酶制剂在饲料中的添加量为每吨饲料加100_200g。所述的复合酶制剂组成为蛋白酶5000_10000U/g、甘露葡聚糖酶1000_3000U/g、 糖化酶 700-3000U/g，木聚糖酶 7500-15000U/g、淀粉酶 500_3000U/g、纤维素酶 200-700U/ g、植酸酶 50-80U/g、果胶酶 100-200U/g、脂肪酶 200_500U/g。本专利技术的复合酶有不同的作用机制，在饲料中的添加可减少其抗营养作用，提高饲料利用率，提高动物生产效率，充分发挥动物的生产性能。本专利技术通过模拟体内胆酸盐环境、人工胃液、人工肠液和动物试验证明该菌株对胆盐、人工胃液、人工肠液有很强的耐受能力，对试验动物表现出安全性和促增长能力，这为有效提高该菌株的产酶能力，在发酵过程中能够同时产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等，实现一菌多酶发酵奠定了基础。该菌株产生的多种酶之间相互协同作用效果强，可作为饲料添加剂应用于畜、禽、水产动物等农业生产。产酶菌株的筛选I.产木聚糖酶菌株的筛选 将已活化的菌株刺种在木聚糖酶筛选培养基上，在37°C恒温培养24h，根据菌落周围是否有透明圈产生，判断其是否产生木聚糖酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小确定其分泌木聚糖酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产木聚糖酶活性高的菌株。2.产蛋白酶菌株的筛选将已活化的菌株刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37°C温箱中培养24h，根据菌落周围是否有酪素水解圈产生，判断其是否产生蛋白酶。用直尺分别测量水解圈与菌落的直径，根据两者比值大小确定其分泌蛋白酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产蛋白酶活性高的菌株。3.产植酸酶菌株的筛选将已活化的菌株刺种在植酸酶初筛培养基上，在30°C温箱中培养48h，根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生植酸酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生植酸酶活性的高低，并以比值大于等于2 时判其为产植酸酶活性高的菌株。4.产果胶酶菌株的筛选将已活化的菌株刺种在果胶酶初筛培养基上，在37°C温箱中培养36h，取出后，在菌落周围滴加几滴CTAB溶液，静置IOmin后观察透明圈。根据菌落周围是否产生透明圈来判断其是否产生果胶酶。用直尺分别测量透明圈的直径(D)和菌落直径(d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生果胶酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产果胶酶活性高的菌株。5.产脂肪酶菌株的筛选将已活化的菌株刺种在脂肪酶初筛培养基上，在37°C温箱中培养24h，根据菌落周围是否产生水解圈来判断其是否产生脂肪酶。分别测量水解圈的直径(D)和菌落直径 (d)，根据两者的比值大小来初步确定其产生脂肪酶活性的高低，并以比值大于等于2时判其为产脂肪酶活性高的菌株。6.产甘露聚糖酶菌株的筛选将已活化的菌株刺种在甘露聚糖酶筛选培养基上，37°C培养24h后，用刚果红水溶液检测菌落周围是否产生透明圈及其大小，作为产甘露聚糖酶筛选的依据。，并以比值大于等于2时判其为产甘露聚糖酶活性高的菌株。 7.产糖化酶菌株的筛选将活化后的菌株刺种糖苷酶筛选培养基上，37°C培养36h，采用革兰氏碘液染色， 在菌落周围有透明圈产生证明其产糖化酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为产糖化酶活性高的菌株。8.高产淀粉酶菌株的筛选将活化后的菌株刺种可溶性淀粉培养基平皿上，在37°C温箱中培养24h，采用革兰氏碘液染色，根据菌落周围是否有透明圈产生判断其是否产生淀粉酶。分别测量透明圈直径和菌落直径，并以比值大于等于2时判其为高产淀粉酶的菌株。9.高产纤维素酶菌株的筛选9.高产纤维素酶菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一菌多酶菌株，其特征在于，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC？NO：M？2011286。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一尘，张谦，李宏伟，张春杰，汪洋，关随霞，龚婷，丁轲，李小康，吴庭才，李银聚，王臣，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：