用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法技术

一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法，其特征在于它的生产步骤如下： １）工程菌发酵 从固体培养基上挑取单菌落接入５～１５０ｍＬ含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到１０～５００ｍｇ／Ｌ，２５～３７℃，１２０～２８０ｒｐｍ摇床中培养８～３０小时，按０．１～１０％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到１０～５００ｍｇ／Ｌ，２５～３７℃，１２０～２８０ｒｐｍ摇床中培养４～１２小时，再按０．１～１０％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其浓度为２５～１００ｍｇ／ｍＬ，２５～３７℃，１２０～２８０ｒｐｍ摇床中培养２～８小时，然后加入终浓度为０．１～１ｍＭ的安慰性诱导剂异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养４～１２小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内； ２）超声波破胞 用冷冻离心机将发酵液于４～２０℃下以１０００～８０００ｒｐｍ的速度离心５～３０ｍｉｎ，弃上清，用２５～１５０ｍＬ ０．０５Ｍ、ｐＨ８．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液）悬浮１Ｌ发酵液所培养的菌体，将装有２０～５００ｍＬ悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率３００～６５０Ｗ，工作时间３～５秒，间隔时间３～１０秒，共工作８０～１５０次。４～１０℃下１００００～１８０００ｒｐｍ离心３０～９０ｍｉｎ，收集上清液于４～２０℃下保存备用； ３）亲和吸附 在自动层析系统上将５～５０ｍＬ破胞后的离心上清液以０．５～５．０ｃｍ／ｈ的线速度进样到Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含０～３０ｍＭ咪唑和０～５００ｍＭ ＮａＣｌ的缓冲液清洗层析柱，清洗１～５个柱体积，最后用含２００～１０００ｍＭ咪唑的缓冲液、以１．０～１０．０ｃｍ／ｈ进行洗脱直至出峰（２８０ｎｍ吸收峰），收集该峰洗脱液； ４）凝胶分离 将０．５～２．５ｍＬ上面的洗脱液以线速度０．５～４．０ｃｍ／ｈ加到自动层析系统Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５凝胶层析柱中，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长２８０ｎｍ下进行检测，收集第二个峰的洗脱液（保留体积约为８～１４ｍＬ），收集体积为２～１０ｍＬ； ５）冷冻干燥 将凝胶分离后的收集液于－３５～－４５℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得５０～３５０ｍｇ白色干粉状新型小分子伴侣ＧｒｏＥＬ １９１－３４５。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
分子伴侣(molecular chaperone)是一类相互之间没有关系的蛋白，其功能是帮助含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价组装。这一名称最早由Laskey于1978年首次提出，但直到1987年，Ellis正式给出分子伴侣的概念，分子伴侣协助蛋白质的折叠组装才真正被人们所认识和重视。分子伴侣属热休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsp)，主要包括伴侣蛋白Hsp60、Hsp70和Hsp90三个蛋白质家族。细胞内部是一个大分子高度拥挤的环境，蛋白质浓度可达300mg/mL左右，如此高的浓度使大分子的缔合常数(association constants)增加了102~103倍，正是细胞长期进化发展起来的分子伴侣系统才得以保证肽链的正确折叠。在蛋白质合成过程中，至少50％的蛋白与Hsp70结合，大肠杆菌内约10％、真核生物内约占15％的新合成的蛋白会与Hsp60结合进而完成折叠。Hsp70主要与新生成肽链的疏水部分结合，以抑制蛋白质合成过程中的新生肽链的聚集，而一旦蛋白质合成完成，Hsp60则在其折叠过程中发挥重要作用。随着新的基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：关怡新，姚善泾，高永贵，张佳艺，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：