多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装、小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞。本发明专利技术方法简便、易操作、效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞，它在形态学、表观遗传学、全基因表达谱及分化潜能方面与胚胎干细胞(ESCs)极其相似，其优点是个体特异来源的iPS细胞能避免免疫排斥问题。同时iPS细胞生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题。科学研究等工作中需要多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的。本专利技术的技术解决方案是:一种，其特征是:包括下列步骤: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包装(I)转染前质粒的准备1.1重组质粒Pac I单酶切，37°C酶切2h ；1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质权浓度；(2)转染2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5X105个细胞，种于6孔板，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜；2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opt1-MEM培养液；2.3取2 μ g线性化的质粒加入250 μ I经37°C预热的Opt1-MEM中，混勻；2.4取5“ llipofectamine2000 加入 250μ I Opt1-ΜΕΜ 中，混匀，室温放置 5min ；2.5将500 μ I复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37°C，5%的CO2的培养箱中培养5-6小时后,换上完全培养液,继续置培养箱中培养；2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至IOcm培养皿中，加入IOml完全培养基；2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，_80°C保存；(3)用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；(4)初级病毒液的扩增4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在IOcm培养皿中以3X IO6细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90% ；4.2感染时在IOcm皿中加入100 μ I初级病毒液，混匀；4.3在37°C，5%的CO2的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管；4.5将收集的细胞置于_80°C，30分钟，随后置于37°C 15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于_80°C保存备用；(二)小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合笼；(2)每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5 天； (3)取怀孕12.5 13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；(7)用显微剪将鼠胚躯干剪成lmm3以下的碎块，吸置于离心管内；(8)室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；(9)向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；(10)离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%_90%融合时传代或冻存；(11)在第3 5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10 μ g/ml，放回培养箱处理2.5小时；(12)将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；(13)弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；(14)消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6 X IO4个/cm2 ；(15)待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；(16)将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；(三)MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞(I)先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出IXIO5个细胞用于感染实验所需的细胞量；(3)将所需的含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45 μ m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；(4)将IXlO5的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μ I助转剂polybrene,助转剂polybrene使用浓度为10 μ g/ml,将整个体系混勻后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37° C培养箱中，10小时后去病毒；(5)将上述慢病毒感染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔IXio4的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上；(6)第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次；(7)细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞；(四)小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞(I)小鼠iPS细胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于IOOmm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数；(2)将所需的分别含目的基因rox-l，NeuroD, MafA的腺病毒载体Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一个 15ml 离心管中，混匀后，用0.45 μ m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；(3)将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次；(4) 6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中；(5)待大量细胞自胚 体爬出时消化传代。本专利技术方法简便、易操作、效果好。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1小鼠iPS细胞克隆在显微镜下的形态(X 200)图。图2 (A)第16代小鼠iPS细胞克隆的碱性磷酸酶染色(X 200) (B)第16代小鼠iPS细胞克隆的干细胞表面标记Nanog、ReX-l及SSEA-1的免疫荧光染色(X400) (C)小鼠iPS细胞干细胞内源基因的RT-PCR检测结果(D)小鼠iPS细胞的核型图。图3A)小鼠iPS细胞来源的胚体在体视显微镜下的形态(X60) (B)小鼠iPS细胞来源的胚体三胚层基因的RT-PCR检测结果(C)小鼠iPS细胞形成畸胎瘤的HE染色。图4是I3DX-UNeuroD和MafA转染的小鼠iPS在荧光显微镜下同一视野的明视本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是：包括下列步骤：（一）含目的基因PDX?1，NeuroD，MafA腺病毒包装（1）转染前质粒的准备1.1??重组质粒Pac?I单酶切，37℃酶切2h；1.2??采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度；（2）转染2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO2?的培养箱中培养过夜；2.2第二天转染前移去培养液，换2ml?Opti?MEM培养液；2.3取2μg线性化的质粒加入250μl经37℃预热的Opti?MEM中，混匀；2.4取5μl?lipofectamine2000?加入250μl?Opti?MEM中，混匀，室温放置5min；2.5将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37℃，5％的CO2的培养箱中培养5?6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；2.7每2?3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，?80℃保存；（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；（4）初级病毒液的扩增4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×106细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%；4.2感染时在10cm皿中加入100μl初级病毒液，混匀；4.3在37℃，5％的CO2的培养箱中培养至80?90%细胞变圆并漂浮；4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管；?4.5将收集的细胞置于?80℃，30分钟，随后置于37℃?15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml?DMEM培养液中，分装小管，放置于?80℃保存备用；（二）小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼；（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天；（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；（4）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内；（5）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；（6）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml?0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；（7）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%?90%融合时传代或冻存；（8）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml，放回培养箱处理2.5小时；（9）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；（10）弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；（11）消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6×104个/cm2；（12）待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；（13）将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；（三）MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞?（1）先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；（2）用0.25%?trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出1×105个细胞用于感染实验所需的细胞量；（3）将所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；（4）将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μl助转剂polybrene，助转剂polybrene使用浓度为10μg/ml，将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37°C培养箱中，10小时后去病毒；（5）将上述慢病毒感染后的细胞用0.25%?trypsin/...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王志伟，朱铭岩，范向军，陆玉华，朱沙俊，王尧，郭青松，王雷，黄龑，薄祥坤，常旭，袁骁琪，张太哲，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：