【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，涉及一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法。
技术介绍
原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55%。全国第三次死因回顾抽样调查报告显示:肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在城市和男性则是首位死因)。肝癌在诊断时多已晚期，其治疗方法有限，如何有效治疗肝癌是我国目如亟需解决的重大问题。近年来，RNA干扰成为一种潜在的癌治疗方法。RNA干扰是一种特异性的基因沉默方法。自发现以来已经迅速发展成为基因研究的有力工具并成为一种具有极大潜在价值的治疗方法。迄今为止已有的研究已证实其在疾病治疗方面的有效性和可行性。肝癌是一种基因功能改变引起的疾病。近年来，系统生物学水平的研究取得前所未有的巨大进展，确立了诸多重要的致癌基因，这些癌相关基因的发现为肝癌治疗提供了前所未有的巨大机遇。此外，因为RNA干扰物质易于给入肝脏，肝肿瘤适合进行RNA干扰治疗(肝肿瘤动物模型已作为一个优良的研究模型广泛用于RNA干扰治疗的研究)。因此，RNA干扰治疗在肝癌治疗方面具有巨大的潜能。可以 预见的是在不远的将来RNA干扰治疗一定会广泛应用于肝癌治疗。但是，尽管RNA干扰作为一种治疗方法具有巨大潜力，要使其成为一种有效的治疗方法必须解决几个问题。这些问题包括RNA干扰的特异性，RNA干扰作用的持续性，RNA作用的效能等。RNA干扰表达必须局限于肝癌细胞内，非肝癌细胞(如正常肝细胞)应免于RNA干扰作用已避免和消除RNA干扰的副作用。这对于...
【技术保护点】
一种肝癌组织特异性RNA干扰系统，其特征在于，由AFP?Cre载体和LoxP?shRNA载体组成，AFP?Cre载体和LoxP?shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP?Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因，LoxP?shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子和位于其下游的shRNA序列，LoxP?shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子为在U6启动子中插入一个可指示AFP?Cre/LoxP?shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP?Cre/LoxP?shRNA系统是否工作的结构为LoxP?CMV?eGFP?LoxP。
【技术特征摘要】
1.种肝癌组织特异性RNA干扰系统，其特征在于，由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子和位于其下游的shRNA序列，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV_eGFP-LoxP。2.权利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统，其特征在于，所述的shRNA序列为针对靶基因的shRNA序列。3.利要求1所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统的建立方法，其特征在于，具体步骤为: 步骤1:构建AFP-Cre载体: 步骤1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP启动子序列，根据其序列改造设计并人工合成新的AFP启动子片段，以NheI和EcoRI限制性内切酶酶切pUC57质粒，T4连接酶连接，将AFP启动子片段克隆入pUC57质粒，形成含有AFP启动子片段的pUC57_AFP重组质粒，转化感受态细胞DH5 α，扩增，抽提质粒； 步骤1.2:以pUC57-AFP重组质粒为模板，以Gecp-1，2为引物，常规PCR扩增获得AFP启动子片段；以pCAG-Cre为模板，以Gecp-3，4为引物，常规PCR扩增获得Cre片段；然后以AFP启动子片段和Cre片段为模板，以Gecp-1，4为引物，行PCR拼接获得全长目的基因片段 AFP-Cre ；步骤1.3:用Spe I和Xba I限制性内切酶对pCDH-CMV-MCS-EFl_Puro质粒进行酶切，酶切产物电泳后回收7.0kb的载体片段，即为P⑶Η-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段； 步骤1.4:将步骤1.2获得的目的基因片段AFP-Cre以同源重组法与步骤1.3获得的pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重组，构建成AFP-Cre重组质粒； 步骤1.5:转化感受态细胞DH5a，挑取转化子行菌落PCR鉴定阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序，测序没有问题的，再接种抽提质粒； 步骤1.6:表达载体包装、浓缩及滴度测定:选择生长旺盛期293T细胞铺板，将AFP-Cre重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaC12溶液混合后加入培养皿中常规培养；转染24小时后收取上清病毒液，高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；最终形成的AFP-Cre慢病毒颗粒即为AFP-Cre载体； 步骤2:构建LoxP-shRNA载体: 步骤2.1:以pSil02质粒为模板，以Gecp-5和Gecp-6为引物，采用常规PCR扩增获得片段A ;以pSil02质粒为模板，以Gecp-7和Gecp-8为引物，采用常规PCR扩增获得片段B ；以pSil04质粒为模板，以Gecp-9，Gecp-10, Gecp-1l和Gecp-12为引物，采用常规PCR扩增获得片段C ；以Gecp-5和Gecp-8为引物，以片段A、B、C为模板，行PCR获得片段D，即为U6-LoxP-CMV-eGFP-U6 结构片段； 步骤2.2:以XhoI和EcoRI限制性内切酶分别酶切片段D和pSil02质粒，T4连接酶连接，将片段D克隆入pSil02质粒形成LoxP-shRNA重组质粒； 步骤2.3:转化感受态细胞，扩增，测序鉴定阳性克隆，接种阳性克隆后扩增，进行质粒抽提；步骤2.4:表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊嘉，史颖弘，彭远飞，丁振斌，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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