本发明专利技术属于病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)的重组假型杆状病毒的构建、疫苗制备及应用。本发明专利技术得到的重组假型杆状病毒含有双表达盒，既含PPH启动子驱动RVG表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒，又含CMV启动子驱动RVG在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒。用该重组杆状病毒制备的狂犬病疫苗具有亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的双重特性。免疫小鼠后，能刺激机体产生高水平的狂犬病病毒特异性ELISA抗体、中和抗体以及IFN-γ，具有潜在的疫苗应用价值。该重组杆状病毒BV-RVG/RVG保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC?NO：V201022。本发明专利技术还包含了该重组杆状病毒疫苗的制备及应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒学和基因工程
，具体涉及一种表达狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(G蛋白)的重组假型杆状病毒的构建，本专利技术还涉及以该重组假型杆状病毒制备的疫苗及应用。
技术介绍
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的，可以导致人和哺乳动物发生急性脑炎和周围神经炎症的一种人兽共患病。狂犬病的临床特征为恐水、怕风、咽肌痉挛及进行性麻痹等，一旦发病，死亡率几乎达100%。狂犬病的发生最早可以追溯到公元前2300年，迄今仍在世界范围内流行。在亚洲，每年报道人的狂犬病约3.5万例，其中94%是由患病犬或携毒犬咬伤引起的。近年来，我国平均每年因狂犬病而死亡的人数达2000-3000例，且一直呈逐年上升的趋势，尽管我国已广泛使用了高质量的细胞培养灭活疫苗，也在一定程度上取得了令人满意的效果，但狂犬病对我国(尤其是农村和山区)人民正常生活的威胁仍然日趋明显。狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),同一科的病毒还包括水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、牛流行热病毒(Bovine Ephemeral FeverVirus, BEFV)等。其病毒粒子形态呈子弹状,长180nm,直径75nm,头部为半球形,末端常为平端，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。基因组为单链不分节段的负链RNA，大小约12kb。每个RV粒子由一个分子的基因组RNA和五种蛋白组装而成。这五种蛋白分别为:(I)依赖RNA的RNA聚合酶(L蛋白)；(2)糖蛋白(G蛋白)，为狂犬病病毒的主要免疫原性蛋白；(3)核蛋白(N蛋白)，为磷酸化的蛋白；(4)磷酸蛋白(P蛋白)；(5)基质蛋白或膜蛋白(M蛋白)。其中糖蛋白与病毒的感染和免疫密切相关(殷震.动物病毒学.科学出版社，1997，第二版 329-331)。 糖蛋白是RV粒子的表面膜蛋白，以三聚体的形式定位于病毒的表面，形成病毒的棘状突起(Gaudin Y, Ruigrok Rff, Tuffereau C et al.Rabies virus glycoprotein isa trimer.Virology, 1992,187:627-632) 0它由四个功能区组成，分别是前19个氨基酸的信号肽、20-439位氨基酸的膜外区(抗原区)、440-461位氨基酸的跨膜区、462-504位氨基酸的膜内区(附着区)(Fu S，Deisseroth AB.Use of the cosmid adenoviral vectorsystem for the in vitro construction of recombinant adenoviral vectors.Hum GeneTher, 1997,8:1321-1330) 0 RV G蛋白是有效的保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应(Saxena S，Dahiya SS, Sonwane AA et al.A sindbis virus replicon-basedDNA vaccine encoding the rabies virus glycoprotein elicits immune responses andcomplete protection in mice from lethal challenge.Vaccine，2008，26:6592-6601)。以单克隆抗体中和实验技术研究G蛋白上的抗原结合位点，发现G蛋白上至少存在3个中和抗体结合位点。由于G蛋白与狂犬病病毒的毒力及致病性密切相关，而且又是狂犬病病毒的主要保护性抗原，越来越多的研究关注G蛋白在狂犬病防治中的应用。狂犬病疫苗诱导机体产生中和抗体的水平主要取决于G蛋白的量，表达G蛋白基因的重组活病毒载体疫苗在狂犬病的预防中展现了良好的应用前景。研究证实表达RV G蛋白的重组痘苗病毒经消化道免疫狐狸，能诱导机体产生抗狂犬病病毒的中和抗体，可有效地保护狐狸抵抗狂犬病病毒的感染(Lambot M, Blasco E, Barrat J et al.Humoraland cell-mediated immune responses of foxes(Vulpes vulpes)after experimentalprimary and secondary oral vaccination using SAG2 and V-RG vaccines.Vaccine,2001，19:1827-1835)。在欧洲与美国，通过大量投放这种重组狂犬病口服活疫苗，对控制狂犬病病毒在狐狸与浣熊等野生动物中的流行发挥了重要作用。然而，由于痘苗病毒本身具有潜在的致病性，因此，重组痘苗病毒活疫苗不能用来免疫家养动物。为了获得安全、高效、廉价的狂犬病基因工程疫苗，也有研究人员用其它的无致病性的表达系统表达G蛋白来研制亚单位疫苗。Fu等证实，浣熊口服杆状病毒表达的狂犬病病毒G蛋白疫苗，可诱导机体产生抗狂犬病病毒的中和抗体，并能保护浣熊抵抗狂犬病病毒高致病性毒株的攻击(Fu ZF,Ruppreeht CE, Dietzschold B et al.0ral vaccination of raccoons(Procyon lotor)with baculovirus-expressed rabies virus glycoprotein CJ7.Vaccine,1993,11:925-928)。但由于G蛋白不易纯化，研制狂犬病病毒G蛋白亚单位疫苗的进展缓慢，因此，许多研究转向利用G蛋白基因构建DNA核酸疫苗。DNA疫苗不但能诱导体液免疫和细胞免疫，而且具有生产简便、成本低廉、稳定性好等优点。用表达狂犬病病毒G蛋白的质粒经肌肉免疫小鼠，能诱导高水平的体液免疫与细胞免疫，并能保护80 %以上的小鼠抵抗狂犬病病毒的攻击。最新的研究还发现，用表达狂犬病病毒G蛋白的DNA疫苗经皮内免疫犬I次，机体不但能产生高滴度的中和抗体，维持时间长，而且能保护免疫犬在免疫I年后仍能抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击(Lodmell DL, Ewah LC, Parnell MJ et al.0ne-timeintradermal DNA vaccination in ear pinnae one year prior to infection protectsdogs against rabies virus.Vaccine，2006，24:412-416)。G蛋白不仅能诱导很强的中和抗体，还能刺激机体产生细胞免疫反应。研究发现，RV激活的天然免疫反应，尤其是IFN-α/β的上调表达，与RV G蛋白的表达水平密切相关。在中枢性神经系统和初级神经元细胞上，减毒RV表达G蛋白的量是高致病性RV表达量的3倍以上，且两者诱导 的炎症反应和G蛋白的表达量呈反相关。通过基因芯片分析和real-time PCR验证表明，在减毒RV感染的小鼠体内能检测到大量炎症因子的上调表达，而高致病RV感染引起的炎症反应很弱甚至没有。而且，减毒RV能诱导许多与天然免疫和抗病毒效应相关的基因上调表达，尤其是与IFN-α/β以及炎症趋化因子信号通路有关的分子。其中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组假型杆状病毒BV?RVG/RVG，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC?NO：V201022，其特征在于，该重组病毒具有表达狂犬病病毒G蛋白的双表达盒，既含有PPH启动子驱动狂犬病病毒G蛋白表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒PPH?RVG?poly(A)，又含有CMV启动子驱动狂犬病病毒G蛋白在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒CMV?RVG?poly(A)，其中所述的狂犬病病毒G蛋白核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.株重组假型杆状病毒BV-RVG/RVG，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:V201022，其特征在于，该重组病毒具有表达狂犬病病毒G蛋白的双表达盒，既含有Pph启动子驱动狂犬病病毒G蛋白表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒PPH-RVG-poly (A)，又含有CMV启动子驱动狂犬病病毒G...
【专利技术属性】
技术研发人员：方六荣，吴群峰，肖少波，于福来，傅振芳，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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