本发明专利技术涉及一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，属于分子生物技术领域。它含有逆转录病毒gag基因，pol基因，env基因，逆转录病毒调节基因，编码LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。本发明专利技术第一次提出可以在高滴定度和高浓度条件下制造载体系统。载体颗粒可以在没有任何传染性物质损失的情况下被纯化。本发明专利技术的细胞系具有宽且跨种系的宿主细胞谱。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，属于分子生物
技术介绍
逆转录病毒载体在新技术中的应用越来越多，例如基因工程中的基因转移、医学研究以及基因治疗等领域(例如C. Baum等人1998年在Gerson & Lattime学术出版社出版的《肿瘤学术讨论基因治疗对于癌症，翻译方法从临床前期研究到临床实施》)。大部分逆转录病毒是来源于小鼠白血病病毒(MLV)。他们含有保持病毒完整性必需的所有LTR区序列以及负责包装功能的Ψ元件。而编码病毒蛋白的区域则被替换为研究人员想要转入人类细胞的外来基因以及控制序列。这些载体在辅助细胞系(也称为包装细胞系)中表达，这些细胞含有逆转录病毒基因组的完整拷贝。上述细胞系能够合成病毒复制和感染所需的所有蛋白，但是由于它们缺乏Ψ元件，所以不能将病毒的基因组RNA包装到病毒蛋白颗粒中。如果逆转录病毒载体插入到辅助细胞基因组中并发生转录，含有Ψ元件的转基因mRNA能够形成并与辅助病毒蛋白作用,然后被包装到病毒颗粒中。不含病毒任何遗传信息的重组病毒颗粒通过它们的表面蛋白被细胞吸收。病毒衣壳在细胞质中被分解，而转基因RNA被转换为双链DNA并整合到宿主细胞基因组中。这一系统的优势在于基因的整合能够通过细胞分裂稳定地遗传给下一代细胞。而它的劣势在于整合的位点是随机的。逆转录病毒载体采用一种稳定的共轭整合(比如说不对载体基因组序列进行重组和重排)，从而使转入的基因能够长期表达。除上述方法外，目前能够做到基因长期表达的只有游离疱疹病毒载体和腺病毒载体(AAV载体)。而后者的包装系统(包装细胞系)还没有得到优化。此外，腺病毒载体包装能力较弱(腺病毒载体大概能包装5kb遗传信息，而逆转录病毒载体能包装10_12kb)。除了被转移 的基因外，包装系统还表达含有逆转录病毒顺式元件的载体基因组。载体基因组的转录并不能编码逆转录病毒的蛋白，而是在gag-、pol-和env-基因产物的帮助下形成一个有侵袭能力但不能自我复制的病毒，插入到包装细胞系中。这一病毒能够作为逆转录病毒载体，将转移整合到载体基因组中的基因至目标细胞中，而不会在目标细胞中出现新的载体复制现象。换句话说，病毒载体只能感染目标细胞但是不会在目标细胞中进一步复制。逆转录病毒包装系统的开发已经有了很大成果并能在GMP条件下大量生产不具备病毒复制能力的载体上清。基于小鼠白血病病毒的载体(MLV vectors)已经多次用于临床试验(P. Chu et al.，J. Mol. Med. 76 (1998) 184-192) ·两种基本的逆转录病毒包装体系在之前的文献中已经有报道(J.M. Wilson，Clin.Exp.1mmunol. 107 Supp1.1(1997) 31-32 ；C. Baum et al. 1998)，Ioc cit.)。MLV包装细胞系含有逆转录基因gag (图1)，但是pol和env基因以及包装逆转录病毒 RNA 需要的序列被敲除了 (C. Baum et al.，(1998)，loc. cit.)。另一种已知的包装系统来源于慢病毒(R. Carroll et al.,J. Virol. 68 (1994) 6047-6051 ；P. Corbeau et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 14070-14075 ；L. Naldini et al.，Science 272 (1996) 263-267 ；C. Parolinet al. , J. Virol. 68 (1994) 3888-3895 ；J. Reiser et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 (1996) 15266-15271 ；J. H. Richardson et al.，J. Gen. Virol. 76(1995)691-696 ；T. Shimada et al. , J. Clin.1nvest. 88 (1991) 1043-1047).慢病毒是一种复杂的逆转录病毒，它除了表达gag，pol和env基因产物外还表达一系列调控基因。现有慢病毒包装系统主要来源于人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒包装系统的组成与MLV载体大致相同。慢病毒载体的一大特点是它们能够感染静止期的细胞。而MLV载体基因组只有当细胞分裂时才能转移到细胞核中。不过，由于慢病毒基因组结构复杂，慢病毒来源的包装系统滴度相对较低和稳定性也较差。由于他的基因组结构过于复杂，基因组中的顺式和反式作用原件不能被清晰地区分开。在表达慢病毒gag，pol和env基因的包装结构中，我们也能找到包含在载体基因组中的一些重要的顺式调节序列(例如部分包装信号)。由于上述同源性，载体基因组和包装结构可能发生重组，从而使慢病毒具有复制能力(例如可能会出现野生型的HIV病毒)。所以这一包装系统与MLV包装系统不具备可比性。之前文献中报道的所有载体系统都有一些严重的缺陷，从而使它们不能在基因治疗中成功应用。1.逆转录病毒载体·的滴度往往过低。由于囊膜蛋白的不稳定性，它们也不能被进一步浓缩。2.同样由于囊膜蛋白的不稳定性，病毒颗粒在纯化时也会损失一部分侵袭性。由于含有病毒载体的细胞培养上清液中污染了细胞组分，所以上述纯化过程又是必需的。3.由于囊膜蛋白的特性，逆转录病毒载体会被人血清组分灭活。4.经典双嗜性载体囊膜蛋白的受体几乎在所有细胞系统表达。但是，多种原代人类细胞(例如肝细胞和造血干细胞等基因治疗靶细胞)中缺少有功能的双嗜性受体。因此这些细胞中的基因转染相对困难或者不能实现。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，而且这一载体没有之前文献报道的载体的缺点。具体来说，本专利技术的目的就是提供一种能将基因稳定地转入靶细胞中的逆转录病毒包装系统。这种包装系统既能使目的基因稳定地整合到靶细胞基因组中，还能使目的基因稳定地表达。上述目标是通过逆转录病毒与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)假型包装实现的。本专利技术是一种含有一个或多个外源基因的重组病毒颗粒。它是通过病毒颗粒与LCMV病毒假型包装得到的。病毒的向性以及稳定性主要是由囊膜蛋白决定的。小鼠逆转录病毒不仅能够整合MLV-env基因编码的糖蛋白，还能够将其他病毒的囊膜蛋白整合到病毒外壳中。因此，我们所说的假型包装就产生了。逆转录病毒假型包装载体是通过在MLV包装细胞系中表达外源病毒囊膜蛋白来获得的。传统的MLV包装细胞系含有逆转录基因gag，pol和env。而包装逆转录病毒基因组RNA所需的序列被敲除了。向上述包装细胞系中引入一个含有目的基因、逆转录病毒包装序列以及其他逆转录病毒顺式原件(LTR，leader)的载体。逆转录病毒基因组RNA在gag、pol和env基因产物的帮助下插入病毒颗粒，形成一个具有侵袭性但是不能复制的病毒。这种病毒能够在细胞转染中用作逆转录载体。假型包装细胞系还含有一个外源病毒的囊膜蛋白。本专利技术中的假型包装细胞系含有LCMV病毒的囊膜蛋白，并且能够表达LCMV病毒的糖蛋白。本专利技术首次本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，它含有逆转录病毒gag基因，pol基因，env基因，逆转录病毒调节基因，编码LCMV病毒糖蛋白GP?1和GP?2的gp基因。
【技术特征摘要】
1.一种假型淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白的慢病毒载体，它含有逆转录病毒gag基因，pol基因，env基因，逆转录病毒调节基因，编码LCMV病毒糖蛋白GP-1和GP-2的gp基因。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述pol基因核苷酸序列如SEQID N0:...
【专利技术属性】
技术研发人员：王剑，
申请(专利权)人：王剑，
类型：发明
国别省市：
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