本发明专利技术提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括XhoI酶切位点和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括XhoI酶切位点、CYP3A4基因编码序列和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。本发明专利技术提供的慢病毒表达载体具有转染效率高、用量少、可特异、持续、高效、稳定地表达CYP3A4基因的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究与开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP3A4属于CYP450家族中的CYP3A亚族，由CYP3A4基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的30-40%，是肝脏中含量最丰富的CYP，也是最重要的人类药物代谢酶。CYP3A4参与代谢大约38类多于150种的临床治疗药物，包括抗生素、抗真菌药物、安定 药物、抗组胺剂、抗抑郁药物、激素以及钙拮抗剂等等，此外，CYP3A4还参与一些前体致癌物的激活过程。因为其广泛的代谢底物谱，许多药物不良反应是由药物相互作用导致CYP3A4的代谢活性改变所引起的。现有技术中，阮昊和徐田雪分别将CYP3A4基因cDNA片段连接到了 pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP3A4基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究；李敏将CYP3A4基因cDNA片段连接到了 pYES2/CT_PCR载体上并将其导入到酿酒酵母BJ5628中实现CYP3A4的稳定表达，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP3A4基因的载体。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和Xma I酶切位点的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl-Cl表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本专利技术。本专利技术提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-Cl表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。采用上述技术方案，本专利技术提供的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl_Cl表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP3A4基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。作为本专利技术的进一步改进，所述CYP3A4基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为5’ -CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即 SEQ ID NO :1，所述下游引物的序列为5’ -ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’JPSEQ ID NO 20采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP3A4基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中持续表达CYP3A4基因，减少了序列合成费用，成本较低。相应的，本专利技术还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤 A)CYP3A4基因引物设计根据CYP3A4基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’ -CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即 SEQ ID NO : I 作为上游引物，选取 5’_ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC -3’，即SEQ ID NO :2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小； B)CYP3A4基因cDNA序列的获得用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获 得大量CYP3A4基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP3A4基因cDNA序列的pGM_T载体，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收1526 bp大小的片段，此片段即为CYP3A4基因cDNA序列； C)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定提取质粒pLVX-AcGFPl-Cl，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA Iigase将所述CYP3A4基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定； D)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的抽提将测序结果证实CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体。本专利技术利用基因工程技术构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒转导入L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP3A4基因表达的变化，实验结果证明本专利技术提供的CYP3A4基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达。本专利技术还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病的药物中的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下本专利技术提供的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究和开发中；本专利技术还提供了特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，操作效果好，减少了序列合成费用，成本较低。附图说明图I为pLVX-AcGFPl-Cl表达载体的质粒图谱。图2为3A4-T载体菌液PCR的结果示意图。图3为pLVX-CYP3A4载体菌液PCR的结果示意图。图4为pLVX-CYP3A4载体测序结果示意图。图5为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。图6为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。 图7为嘌呤霉素筛选细胞连本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pLVX？AcGFP？C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho？I酶切位点和Xma？I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho？I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma？I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐新云，毛侃琅，何晓阳，毛吉炎，应明，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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