本发明专利技术涉及烟草抗番茄黄化曲叶病毒的体细胞无性系突变体的离体筛选方法，属于生物技术领域。以含有番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）侵染性克隆的农杆菌转化烟草叶片，使TYLCV在烟草离体细胞内大量复制而产生病毒筛选压力，通过长时间的组织培养诱发体细胞无性系突变体，突变体植株及其后代植株接种携带TYLCV的烟粉虱进行连续筛选，获得表型正常、无病症的抗TYLCV烟草。本发明专利技术有效克服了病毒或病毒粗提取物不能直接加到培养基里作为选择压进行离体筛选抗病毒突变体的缺陷，为培育抗病毒材料提供了一种新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物
，专用于作物(烟草)抗番茄黄化曲叶病毒细胞工程育种。
技术介绍
番爺黄化曲叶病毒病是由烟粉風携带传播番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl virus, TYLCV)引起的,危害番爺、烟草等重要经济作物生产的一种双生病毒病(刘玉乐，蔡健和，李冬玲，等.中国番茄黄化曲叶病毒一双生病毒的一个新种.中国科学，C辑，1998，28:148-153 ；Zhou X P, Xie Y, Zhang Z K. Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan, China.Archives of Virology, 2001, 146:1599-1606)。该病最早于 1964 年在以色列发生,之后迅速扩散到欧洲、亚洲、非洲以及大洋洲等地区，给番茄生产造成了巨大的损失。自2002年传入我国以来，TYLCVD已在云南、广东、广西、上海、浙江、江苏、河南、山东等地蔓延，严重影响当地农作物的生产，甚至会导致绝收(国艳梅，杜永臣，王孝宣，高建昌.番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的研究进展，中国农业科技导报，2009，11 (5) : 30-35)。由于TYLCV是通过烟粉虱携带传播的，所以化学防治是最直接有效的方法，但随着大量化学药剂的使用，烟粉虱的抗药性越来越强，即使药效很好，也会因大量的使用，对人畜和环境造成影响，因此筛选TYLCV抗源，从而培育高抗TYLCV的品种具有十分重要的意义。但栽培品种中缺乏有效的抗源基因，仅有一些种质表现为耐病，高抗TYLCV基因都存在于近缘野生种质中(Maruthi M. N. , Czosnek H. , Vidavski F·，et al. Comparison ofresistance to tomato leaf curl virus (India) and tomato yellow leaf curl virus(Israel) among Lycopersicon wild species, breeding lines and hybrids. EuropeanJournal of Plant Pathology, 2003, 109 (I):1-11.)。体细胞无性系变异是指通过组织培养过程获得再生植株，再生植株表现与亲本不同特征的现象(Larkin P J. Scowcroft W R. Somaclonal variation- a novelsource of variability from cell culture for plant improvement. Theoretical andApplied Genetics, 1981，60:197-214.)。体细胞无性系变异在某些植物中发生的概率高达30%-40%，某一性状的变异率在O. 2%-3%之间(丰先红，李健，罗孝贵.植物组织培养中体细胞无性系变异研究.中国农学通报，2010，26(14) :70-73.)。目前，体细胞无性系变异已经被广泛应用于烟草、玉米、水稻等作物的种质创新，并获得了有价值的育种突变体，包括抗病突变体(Carlson P S. Induction and isolation of auxotrophic mutantsin somatic cell culture of Nicotiana tabacum. scince, 1970, 168:487-489;陈启峰，陈璋，王金陵.运用致病毒素筛选抗稻瘟质细胞突变体.遗传学报，1993，( 4):340-347;赵晓明，李明山，宋秀英.通过组织培养筛选番茄抗早疫病.山西农业大学学报，1996，16 (4) : 350-353)。其中，大量的抗病突变体是以病原菌产生的毒素作为选择压筛选获得。而通常情况下，植物病毒只有在寄主活体内才能保持其活性，所以病毒或病毒粗提取不能直接加到培养基里作为选择压进行植物抗病毒突变体的离体筛选。TYLCV侵染性克隆是将TYLCV基因组DNA-A串联重复序列克隆到植物表达载体T-DNA区，通过农杆菌介导将T-DNA整合到植物细胞而实现TYLCV基因的转录和表达，主要用于TYLCV侵染宿主进行瞬时表达研究(Zhang H, Gong H R, Zhou X P. Molecularcharacterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China.Virus Ggenes, 2009，39:249-255)。为了获得抗TYLCV烟草突变体，本专利技术以含有TYLCV侵染性克隆的农杆菌转化烟草，通过农杆菌T-DNA将TYLCV的DNA序列整合到烟草基因组内，使TYLCV在植物离体细胞内大量合成和复制，产生病毒筛选压力，借助组织培养过程中产生的体细胞无性系变异，从而实现烟草抗TYLCV突变体的筛选。到目前为止，未见利用侵染性克隆转化烟草筛选获得抗病毒突变体的报道。三
技术实现思路
技术问题 本专利技术涉及，其目的在于克服离体的病毒或病毒粗提物无活性而无法直接加入培养基作为选择压筛选体细胞无性系突变体的缺陷，为获得植物抗病毒材料提供新的方法。技术方案 烟草抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的体细胞无性系突变体的离体筛选方法，包括 1)以含有番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染性克隆的农杆菌转化烟草叶片； 2)转化后的烟草叶片通过长时间的组织培养诱发体细胞无性系突变体； 3)突变体植株及其后代植株接种携带TYLCV的烟粉虱连续筛选，获得表型正常、无病症的抗TYLCV烟草。本专利技术所述的方法，具体步骤如下 1)将消毒的普通烟草叶片剪成Icm2大小，以0D_=0.3-0. 4的含有番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆PTYjOl的农杆菌浸泡10 min，置于MS+l.Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA共培养基上、25°C黑暗培养2天； 2)叶片置于选择培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA +500mg/L 头孢霉素+50mg/L卡那霉素)上、25°C、16/8 h光照周期培养，每隔20天继代一次，连续继代3-4个月； 3)将愈伤组织上长出的I-2 cm新芽切下，转入生根培养基(1/2 MS +500mg/L头孢霉素)上生根培养； 4)表型正常的再生苗经TYLCV特异引物进行PCR鉴定为阳性后，移栽温室内，每株接种50头携带TYLCV的烟粉虱，收获整个生育期都不体现病症的植株自交种子； 5)自交种子播种于温室内再经携带TYLCV的烟粉虱取食，筛选整个生育期都不体现病症的植株。TYLCV特异引物为5’-CGCCCGTCTCGAAGGTTC-3’5’-GCCATATACAATAACAAGGC-3’ ； PCR鉴定方法为 94°C预变性4min，94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸I min，共30个循环，最后72°C下延伸10 min，取IOyL PCR产物在质量百分比为1%琼脂糖胶上进行电泳检测，结果显示本文档来自技高网...
【技术保护点】
烟草抗番茄黄化曲叶病毒的体细胞无性系突变体的离体筛选方法，？其步骤包括：1)？以含有番茄黄化曲叶病毒TYLCV侵染性克隆的农杆菌转化烟草叶片；？2)？转化后的烟草叶片通过长时间的组织培养诱发体细胞无性系突变体；3)？突变体植株及其后代植株接种携带TYLCV的烟粉虱连续筛选，获得表型正常、无病症的抗TYLCV烟草。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余文贵，张保龙，郭佳茹，袁洪波，陈天子，杨郁文，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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