人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达方法技术

本发明专利技术涉及一种人胰岛素基因的分泌表达，特别是人胰岛素基因在甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ　　Ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５／ｐＰＩＣＭ↑［＃］１０１、保藏编号为ＣＣＴＣＣＮＯ．Ｍ２０４０７１中的分泌表达。它包括Ｂ、Ａ链的合成，表达质粒和工程菌构建，宿主细胞的转化，转化子及高表达量工程菌筛选等步骤。本发明专利技术省去了转肽去掉Ｃ链等极为复杂的过程，减少了生产步骤，缩短了工时，因此它具有工艺简单的优点，采用本发明专利技术比其它表达系统高出１０－１００倍的表达量，因此大大提高了产量。它为人胰岛素工业化生产提供了一条新的简捷的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，它涉及一种人胰岛素基因的分泌表达，特别是人胰岛素基因在甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中的分泌表达。
技术介绍
胰岛素是一种由B细胞分泌的唯一能降低血糖的天然激素。它的主要作用在于体内调节血液中葡萄糖的含量并转运葡萄糖到一定的靶细胞中，参与体内三大物质及能量的代谢。人体内血糖的过高或过低都是一种疾病。无论什么原因导致胰岛素分泌的降低，不为体内调节血糖所需，都会引起患者得胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。治疗这类患者，胰岛素是必须的。人胰岛素对任何器官均没有专属性。实际上在肝、肌肉和脂肪细胞中进行的大量代谢活动均有胰岛素参与。有胰岛素存在时，许多组织器官的细胞通透性增加，促进物质从细胞外向细胞内转移。胰岛素可促进葡萄糖进入细胞内，加速其降解，从而使葡萄糖水平下降。血浆中葡萄糖或氨基酸、CAMP以及Ca++水平的升高均会引起胰岛素的释放，因此进食后血浆中胰岛素水平升高。同时，它还能促进骨骼、肌肉、心脏及脂肪组织对糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖原异生，从而降低血糖。临床上应用胰岛素已有80年历史。早期使用的是猪、牛等动物胰岛素，用这些动物的胰腺通过生化提取的方法而获得，来源有限，且原材料的质量难以保证。如果糖尿病人长期使用动物胰岛素，人体会对其产生抗体从而降低其功效，长期皮下注射会在注射部位产生硬结等副作用。基因工程技术的兴起改变了人们生产、利用蛋白质类(包括多肽类)药物的整个生产程序，大大推进了这一领域的发展。利用基因工程技术研制生产胰岛素至今仍是世界性热门课题之一。人胰岛素也是世界上第一个基因工程药物。医用人胰岛素只能由基因工程方法生产，其结构和人体内产生的胰岛素完全一致，不会给患者带来如使用动物胰岛素造成的副作用。生产过程中的原材料的质量可以得到保证，虽然人胰岛素的生产成本较动物胰岛素的生产成本高，但随着人们生活水平的提高，人胰岛素会逐渐被广大的糖尿病患者所接受。从1982年人胰岛素上市以来的发展趋势也可以看出，动物胰岛素会逐渐被基因工程的人胰岛素所取代。由于人胰岛素基因工程生产过程中的技术难度，全球可以生产人胰岛素的厂家为数并不多，主要有美国礼莱(Eli Lilly)，丹麦的诺和诺德(Novo Nordisk)两家。现在，生产人胰岛素的技术基本分为两种一种是将胰岛素的A、B链分别表达，分离纯化后再化学合成人胰岛素(指以化学法促使A、B链间二硫键的形成)；另一种是在宿主细胞内表达人胰岛素原，纯化后酶切除掉链结肽(C肽)而变成胰岛素。当然，每家公司使用的工艺不同，宿主菌前者是大肠杆菌，后者是酵母。C肽可以是2个氨基酸，也可以是多个氨基酸(天然胰岛素含30个氨基酸)。近几十年对胰岛素的研究发现，通过胰岛素链内氨基酸的替换等方法，已生产出一系列胰岛素类似物。它们既具胰岛素的生理活性，又不象天然胰岛素那样容易聚合，以增加生物利用度。天然成熟的胰岛素含有两条氨基酸链即A与B链。A链由21个氨基酸组成；B链由30个氨基酸组成。A、B链之间由2个二硫键互相交连；A链内尚有第3个二硫键。由此形成一定的三维结构，行使上述特定的生理功能。天然的人胰岛素基因首先合成一种含有信号肽的胰岛素原(proinsulin)。胰岛素信号肽为由24个氨基酸组成的一段肽链。由于受其在胞质中内质网上的信号肽受体的吸引而引导新生肽穿过内质网膜进入内质网腔，在内质网腔内由一种与膜结合的蛋白酶将信号肽(Signal(Pre)sequence)切除，剩下的胰岛素原在路经高尔基体时在一系列类似于胰蛋白酶/羧肽酶B的作用下在连续两个碱性氨基酸序列处切去C肽，产生成熟的胰岛素(Steiner et al.Cell Bid.34(1984)121-130)。文献报导C肽在胰岛素成熟过程中起连接A链与B链并形成适当的空间构型，便于胰岛素的成熟(Bell et al.，Nature284(1980)26-32)。文献还证明，C肽的链长度是可以变化的，这种变化不影响最终该基因的表达及活性胰岛素分子的生成。其中C肽最链短的可以是二个氨基酸(EP-0-195691)。啤酒酵母已被用来表达生产多种药用蛋白质。在酵母细胞中合成的蛋白质通过一套特有的机制来完成成熟及分泌过程。通常采用的是α-因子信号(pre)原(pro)引导序列。其中pre序列由19个氨基酸残基组成；而pro序列则由66个氨基酸残基组成。这66个氨基酸残基中包含着3个N-糖基化位点和1个能识别2个碱性氨基酸残基的Kex2内切蛋白酶位点(Waters et al.，JBC(1988)，263，6209-6214)。近年的研究表明，用甲醇酵母来表达外源基因有更多的优点而受到广泛关注。有资料显示该系统可以根据不同的表达基因获得比其他表达系统高出10-100倍的表达量。因为它可以高密度生长及一个可为甲醇严格诱导表达的乙醇氧化酶基因启动子-AOX1。和啤酒酵母一样，甲醇酵母也具有相同的分泌表达机制(Yan Wang et al.，(2001)Biotechnology &Bioengineering73，74-79)。一种胰岛素前体(IP)在此系统中已得到很好地表达(Kjeidsen et al.，(1999)Biotechnol.Appl.Biochem，29，79-86)。但是，这些研究仍然采用传统的方法，先表达纯化出胰岛素原，再经过转肽去掉C链等极为复杂的过程。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种人胰岛素基因在甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中的分泌表达，它解决了现有技术表达基因获得的表达量较低、且需要经过转肽去掉C链等极为复杂的过程的缺陷。本专利技术运用分子生物学成果设计了这一条胰岛素生成形成的新路线，其技术方案为以特殊的方式改变了胰岛素基因，以甲醇酵母表达系统直接分泌表达人胰岛素，其特征在于(1)人胰岛素基因A、B链采用酵母偏爱密码子；(2)人胰岛素A、B链分别置于同一经改造了的甲醇酵母(Pichia Pastoris)GS115/pPICM#101、保藏编号为CCTCC NO.M204071中表达质粒pPIC9K表达盒α-因子信号肽之后，以甲醇进行诱导表达；(3)其表达产物成熟并分泌于酵母培养基中，利于分离纯化。上述人胰岛素基因A、B链全部酵母源化，胰岛素基因B链及A链分别有选择的置于表达质粒pPIC9K AOX1信号肽及引导序列的Kex2酶切位点位点之后，并组建到同一母体pPIC9K表达质粒中，此质粒以电激法转化宿主细胞GS115，其所需部份插入到宿主细胞，使用同样的启动子以相同速率等量表达。将所得的产物用重组质粒筛选法筛选阳性重组子；通过从小到大体积摇瓶培养法系统筛选出高表达量的转化子。本专利技术采用相同的两个启动子，分别等量、同时合成后的A及B链在其后的成熟及分泌过程中可以自然地形成成熟分子的胰岛素。事实上，在利用E.coli表达生产胰岛素时，就是分别表达并纯化A、B链后，在体外特定件下使此二肽人为地形成二硫键，成为成熟活性分子的(Goeddel et al.，(197本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胰岛素基因在甲醇酵母中的分泌表达，其特征在于：（１）人胰岛素基因Ａ、Ｂ链采用酵母偏爱密码子；（２）人胰岛素Ａ、Ｂ链分别置于同一甲醇酵母（ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５／ｐＰＩＣＭ↑［＃］１０１、保藏编号为 ＣＣＴＣＣＮＯ．Ｍ２０４０７１中表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ的表达盒α－因子信号肽之后，进行诱导表达；（３）其表达产物成熟并分泌于酵母培养基中，利于分离纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马延高，马向东，
申请(专利权)人：马延高，马向东，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]