用于生产蛋白质的经改进的宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及用于生产目的重组肽、多肽或蛋白质的宿主细胞及其用于生产目的肽、多肽或蛋白质的用途，其中所述宿主细胞包含至少2个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列。

Improved host cells for the production of proteins

The invention relates to a method for producing recombinant peptides, polypeptides or proteins of the host cell and its use for the production of objective peptide, polypeptide or protein, wherein the nucleic acid sequence of the host cell contains at least 2 copies of the protein encoding.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产蛋白质的经改进的宿主细胞
本专利技术涉及用于重组蛋白生产的异源系统。特别地，本专利技术涉及在基于经改进的毒物-解毒剂系统生产蛋白质的方法中使用的宿主细胞。
技术介绍
现今，微生物广泛地用于蛋白质或DNA生产。通常来说，这些过程需要使用细菌质粒作为载体携带所需表达基因。然而，质粒在微生物内的维持受到限制，并且因此质粒不稳定性代表重组蛋白生产或DNA生产方面的显著问题。已证明携带质粒细胞的生长速率相对于无质粒细胞显著降低。一种理论是质粒复制和转录以及蛋白质生产代表对细胞代谢的显著负担。因此，在发酵过程中，丢失质粒的细胞展现出比仍携带该质粒的细胞更高的适合度，并且前者迅速在细菌群中战胜后者。为了限制细胞群中的质粒丢失并且为了避免无质粒细胞存活下来且在培养物中占主要优势，在质粒中插入选择标记。发酵操作中最常用的选择标记是抗生素抗性基因。然而，从医疗或调节方面考虑，抗生素(或编码抗生素抗性的基因)污染产物或生物质是不能接受的。此外，抗生素抗性基因可在环境中增殖或者转移至致病性菌株。再者，最近的研究表明在生产重组蛋白中使用抗生素抗性基因强烈降低蛋白质生产的产率(Peubez等,MicrobialCellfactories,2010,9:65)因此，需要允许质粒维持，并且没有抗生素抗性基因的缺点的其他系统。使用抗生素抗性基因的一个替代方案是通过插入到质粒中的野生型等位基因来互补必需的突变染色体基因。例如，开发了这样的系统，其中突变宿主在没有携带提供该功能的基因的质粒下不能够合成必需氨基酸。然而，该方法强烈限制了生长培养基的可能选择。开发的另一策略是这样的系统，其中质粒介导的阻遏物滴定战胜置于lac操纵子控制之下的必需染色体基因的阻遏。然而，该方法具有以下限制：(i)其使Lac启动子不能用于其他目的，例如蛋白质表达；(ii)该系统局限于大肠杆菌(E.coli)或其他Lac启动子具有功能性的细菌；以及(iii)必须避免含有乳糖的培养基。使用抗生素抗性基因的另一替代系统基于毒物蛋白(即，对宿主细胞具有毒性的分子)与其解毒剂组合的对。例如，毒物基因可由宿主细胞从染色体拷贝表达，而解毒剂由质粒携带。因此，宿主细胞的存活需要该质粒的存在。毒物/解毒剂对的一个实例是ccdA(解毒剂)/ccdB(毒物)系统。CcdA和CcdB是由大肠杆菌F质粒编码的解毒剂和毒物蛋白。在一起时，他们确保未接受F拷贝的子细胞死亡。ccdB蛋白的表达干扰DNA促旋酶的重新连接步骤，导致宿主细胞染色体被切成片段。解毒剂/毒物对的另一些实例包括但不限于Kis/Kid蛋白、Phd/Doc蛋白、RelB/relE蛋白PasB(或PasC)/PasA蛋白、mazF/maze蛋白。该解毒剂/毒物系统已广泛地用于克隆方法中，如例如美国专利US8,470,580中所述的：将包含编码毒物的基因的宿主细胞与包含编码相应解毒剂的基因的质粒组合使用。因此，该系统允许直接选择整合有目的基因的细胞，因为仅表达解毒剂基因的细胞存活下来。该系统还用于蛋白质生产，如专利技术人之前所述的(Szpirer和Milinkovitch,BioTechniques,2005,38(5):775-781)。出乎意料的是，观察到重组蛋白的生产水平增加3至5倍，表明该系统具有用于生产重组蛋白的巨大潜力。然而，专利技术人观察到，当将该系统用于生产毒性蛋白时，可出现一些缺点，例如，如目的基因突变、解毒剂/毒物系统突变，等等。期望开发经改进的质粒稳定系统，专利技术人对包含与一个拷贝毒物基因组合的一个拷贝解毒剂基因的典型系统进行了改进。令人吃惊且出乎意料的是，显示在宿主细胞的基因组中插入额外拷贝的毒物基因提高质粒的稳定性，而且还提高蛋白质生产的产率(以不相关方式)。专利技术概述因此，本专利技术涉及用于生产目的重组肽、多肽或蛋白质的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少2个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，所述至少2个拷贝在不同于编码针对毒物蛋白的解毒剂蛋白的核酸序列的复制子中。在一个实施方案中，所述毒物蛋白是由SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有至少75％同一性的任意核酸序列编码的CcdB。在一个实施方案中，所述宿主细胞还包含至少1个拷贝的编码针对毒物蛋白的解毒剂蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，所述解毒剂蛋白是由SEQIDNO:13或与SEQIDNO:13具有至少75％同一性的任意核酸序列编码的CcdA。在一个实施方案中，编码解毒剂蛋白的核酸序列由质粒携带，所述质粒还包含插入有或能够插入有编码目的重组肽、多肽或蛋白质的核酸序列的表达系统。在另一个实施方案中，所述表达系统包含选自包含T7启动子、Ptrc、Para和Plac的组的启动子。在另一个实施方案中，所述表达系统包含T7启动子，并且所述宿主细胞还包含优选地插入在所述宿主的基因组中，更优选地插入在T7表达系统中的T7RNA聚合酶基因。在另一个实施方案中，所述表达系统包含T7启动子，并且所述宿主细胞还包含插入在其基因组中的经遗传修饰的噬菌体，优选地所述噬菌体限定为以下噬菌体，其中：-插入T7表达系统，-S、R和/或Q基因失活，并且-Int和/或Xis基因失活。在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌，优选革兰氏阴性细菌，更优选肠杆菌科(Enterobacteriacea)，并且甚至更优选大肠杆菌。在一个实施方案中，本专利技术的宿主细胞还包含基因tonA、galK、araB、araA、lon、ompT、rcsA、hsdR、mrr、endA和recA中至少一个的失活。在一个实施方案中，本专利技术的宿主细胞还包含gyrA基因的至少一个额外拷贝。本专利技术还涉及试剂盒，其包含如上文所述的宿主细胞和载体，所述载体包含至少一个拷贝的编码解毒剂蛋白的核酸序列和至少一个拷贝的插入有或能够插入有编码目的重组肽、多肽或蛋白质的核酸序列的表达系统。在一个实施方案中，编码目的肽、多肽或蛋白质的核酸序列在选自包括T7启动子、Ptrc、Para和Plac的组的启动子控制之下。本专利技术的一个目的是用于生产目的重组肽、多肽或蛋白质的方法，其中所述方法包括培养上述宿主细胞并回收目的肽、多肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述重组蛋白是分泌蛋白、跨膜蛋白或对细菌菌株具有毒性的蛋白质。定义在本专利技术中，下述术语具有以下含义：-本文中使用的“肽”指少于50个氨基酸通过肽键连接在一起的线性氨基酸聚合物；“多肽”指至少50个氨基酸通过肽键连接在一起的线性聚合物；蛋白质特别地指由一个或更多个肽或多肽以及任选地非多肽辅因子形成的功能性实体。-“重组肽、多肽或蛋白质”指由重组DNA，即由人工插入在生产宿主细胞中的DNA产生的肽、多肽或蛋白质。-“毒物蛋白”指对生产该毒物蛋白的宿主细胞具有毒性的蛋白质。因此，本文中使用的毒物蛋白对本专利技术的宿主细胞具有毒性。专利技术详述本专利技术涉及用于生产重组肽、多肽或蛋白质的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少两个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含2个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列或者3、4、5或6个拷贝(或者更多拷贝)的该核酸序列。毒物蛋白的实例包括但不限于CcdB、Kid、Doc、RelE、PasA、MazE或任何其他毒物分子，例如，如来源于或不来源于质粒的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产目的重组肽、多肽或蛋白质的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少2个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列，条件是所述至少2个拷贝在与编码针对所述毒物蛋白的解毒剂蛋白的核酸序列不同的复制子中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.25 EP 14178656.6;2014.08.26 EP 14182341.91.用于生产目的重组肽、多肽或蛋白质的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少2个拷贝的编码毒物蛋白的核酸序列，条件是所述至少2个拷贝在与编码针对所述毒物蛋白的解毒剂蛋白的核酸序列不同的复制子中。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述毒物蛋白是由SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有至少75％同一性的任意核酸序列编码的CcdB。3.根据权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞，其中所述细胞还包含至少1个拷贝的编码针对所述毒物蛋白的所述解毒剂蛋白的核酸序列。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述解毒剂蛋白是由SEQIDNO:13或与SEQIDNO:13具有至少75％同一性的任意核酸序列编码的CcdA。5.根据权利要求3或权利要求4所述的宿主细胞，其中编码所述解毒剂蛋白的所述核酸序列由质粒携带，所述质粒还包含插入有或能够插入有编码目的重组肽、多肽或蛋白质的核酸序列的表达系统。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述表达系统包含选自包括T7启动子、Ptrc、Para和Plac的组的启动子。7.根据权利要求5或6中任一项所述的宿主细胞，其中所述表达系统包含T7启动子，并且所述宿主细胞还包含T7RNA聚合酶基因,所述T7RNA聚合酶基因优选地插入在其基因组中，更优选地插入在T7表达系统中。8.根据权利要求5至7中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯派尔，J·卡韦伦内，B·米歇尔，
申请(专利权)人：德尔菲遗传学公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE