本发明专利技术涉及一种自动化制备无细胞蛋白的设备以及使用其制备蛋白质的方法，并且更具体地，涉及一种自动化制备无细胞蛋白的设备以及使用其制造蛋白质的方法，所述设备包括：包含反应容器的蛋白质表达反应单元，所述反应容器包括多个透析管，该透析管通过开口上部结构设有透析膜；用于加热或者冷却蛋白质表达反应单元的反应温度控制单元；吸液管阵列，包括多个吸液管并能够使用所述吸液管吸取或者排放溶液；吸液管阵列移动单元，能够上下、前后或左右移动吸液管阵列从而移动溶液；设有磁场施加设备的蛋白质纯化单元；以及多孔板安装单元，能够提供多孔板试剂盒，所述多孔板安装单元供应用于蛋白质生产的溶液。此外，本发明专利技术涉及自动化制备无细胞蛋白的设备及其制备方法，其除亲和标签目标蛋白之外还能够合成无亲和标签的纯目标蛋白，并能够通过多步透析自动且快速地用所需蛋白质储存缓冲液替换含有最终纯化蛋白的洗脱溶液，并且因此可以自动且方便地大量生产多种蛋白质。此外，本发明专利技术涉及用于自动化制备无细胞蛋白的反应试剂盒，包括用于存储制备蛋白所需的溶液的多孔板试剂盒；以及设有透析膜的透析管。根据本发明专利技术的自动化制备无细胞蛋白的设备除了可以自动表达靶标蛋白并将其纯化以外，还可以在蛋白质储存缓冲液中进行透析，因此最终制备的蛋白能够即刻得到使用。此外，本发明专利技术的制备蛋白的方法可以通过多级交换低分子量表达溶液而连续提供无细胞表达所需的能量源，使得相比于通过使用常规制备无细胞蛋白的方法获得靶标蛋白，可以多获得最大5倍的靶标蛋白，并且由于当使用磁铁颗粒纯化靶标蛋白，使用蛋白酶除去不必要的亲和标签制备纯靶标蛋白，本发明专利技术在用于工业、医学和研究目的的蛋白生产非常有用，其中可以制备去除了对蛋白活性和结构赋予副作用的人工序列的环形蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种自动化无细胞蛋白质生产系统以及一种使用该系统生产蛋白质 的方法。更具体地说，本专利技术涉及一种自动化无细胞蛋白质生产系统，包括：包含反应容器 的蛋白质表达反应单元，所述反应容器包括多个透析管，每个透析管包括透析膜并且顶部 开放；用于加热或者冷却反应容器的反应温度控制单元；吸液管阵列，包括多个吸液管并 使用所述吸液管吸取或者排放溶液；吸液管阵列移动单元，在上下方向、前后方向或左右方 向移动吸液管阵列从而移动溶液；包括磁场施加装置的蛋白质纯化单元；以及多孔板安装 单元，其中安装有多孔板试剂盒，所述多孔板安装单元供应用于蛋白质生产的溶液，并且本 专利技术涉及使用该系统生产蛋白质的方法。 另外，更具体地说，本专利技术涉及一自动化蛋白生产系统和方法，其除亲和标签目标 蛋白之外还能够合成无亲和标签的纯目标蛋白，并能够通过多步透析自动且快速地用所需 蛋白质储存缓冲液替换含有最终纯化蛋白的洗脱溶液，并且因此可以自动且方便地大量生 产多种蛋白质。 此外，本专利技术涉及用于自动化无细胞蛋白质生产的反应试剂盒，其包含用于存储 蛋白质生产所需溶液的多孔板试剂盒，以及含有透析膜的透析管。
技术介绍
通常使用不同细胞株，例如使用E. coli、酵母和动物细胞实施生产重组蛋白的方 法。这些方法包括将重组蛋白表达载体转化至细胞株，培养细胞株以表达目标蛋白以及裂 解细胞以纯化目标蛋白。 这些方法需要筛选用以稳定地表达重组蛋白质的菌株的过程，并且接下来要进行 包括细胞培养、细胞破碎和蛋白质纯化的一系列过程。因此，这些方法需要大量的时间和精 力。 此外，细胞毒性蛋白质或膜蛋白质难以表达。因此，在这些蛋白质的情况下，需要 诸如尝试不同的表达条件等很多努力。为此，存在着生产一种蛋白质就需要几天到几个月 的时间这一问题。 为了克服这个问题，已研发出无细胞蛋白质表达方法和与其相关的产品，所述方 法在不使用细胞的条件下，短时间内于反应容器如试管中表达蛋白。这些方法旨在不用细 胞培养来表达所需的蛋白质。这些方法使用包括目标基因的载体、细胞培养后通过分离/ 纯化获得的细胞提取物以及包括氨基酸、三磷酸核糖核酸、能量源和缓冲液的蛋白质表达 溶液。在这些方法中，利用细胞提取物中含有的RNA聚合酶将编码所需蛋白质的基因转录 成mRNA，并利用细胞提取物中含有的核糖体、tRNA等将mRNA翻译为蛋白质。 Roche、Promega等已经将无细胞蛋白质表达方法商业化。在这个方法中，将能表达 蛋白质的模板DNA (例如表达载体、PCR产物等），细胞裂解液以及包括氨基酸、三磷酸核糖 核酸、能量源的表达溶液加入试管，然后使其在合适温度（30_40°C )下反应合适时间（1-3 小时）以表达目标蛋白。此方法优于使用细胞表达蛋白质的方法在于极大地减少了所需时 间，并能够表达细胞毒性蛋白质或膜蛋白质。 此外，已研制出能通过自动化实施无细胞蛋白质表达方便地生产蛋白质的系统。 此系统包括由Roche研制的RTS (快速翻译系统）。RTS能够高效率地实施无细胞 蛋白质表达。在此系统中，为了防止在无细胞蛋白质表达过程中因为能量源耗尽和蛋白质 合成抑制剂（如磷酸）的积累导致反应停止，在反应容器底端配置透析膜。关于透析，为了 使反应最大化，将反应容器置于至少10倍体积的容器中，该容器包含小分子表达溶液。如 Kim, D. -M. and Choi, C. -Y.，Biotechnol. Prog.，12 (5) : 645, 1996 所述，这是基于通过透析 膜连续不断地替换包括三磷酸核糖核酸、氨基酸、能量源的小分子表达溶液，能够使蛋白质 表达水平提高达10倍的原理。 然而该方法存在一个问题，即还要使用体积相当于表达溶液体积的至少10倍的 小分子表达溶液，反应容器的总体尺寸变得更大，因此当同时平行合成不同种类的蛋白质 时，系统的尺寸显著增大。另外，这个系统不是自动化的，在某一温度下只能实施搅拌反应 溶液的功能。因此，要实施诸如反应后合成蛋白质的纯化的单独步骤。 RIKEN研宄所（日本）通过构建这个大型系统实现了蛋白质的自动化表达，但是 没有说明该系统的具体结构（Alexander Spirin&James R. Swartz, Cell-Free Protein Synthesis, 103页，图6. 3B)。Yaeta Endo等人开发了一种利用小麦胚芽提取物的无细胞表 达蛋白质的方法，和一种基于不同于RTS系统的原理的自动化系统。并且，Yaeta Endo等 人通过用小分子表达溶液稀释无细胞蛋白质表达溶液并浓缩稀释液能够提高蛋白质表达 产量（US 2006/0257997 A1)。 然而，上述自动化系统由于结构复杂而存在价格昂贵的问题，而且没有蛋白质纯 化功能，如RTS系统，生产几种蛋白质是很困难的。 同时，含有通过细胞培养或者无细胞蛋白质表达方法表达的重组蛋白质的样品中 含有除目标蛋白以外的不同种类的蛋白质。为了容易地从这个样品中纯化目标蛋白，应用 连接亲和标签（组氨酸标签）的技术。在这个技术中，当组氨酸标签的编码序列被导入模 板基因中时，组氨酸标签连接到由模板基因产生的蛋白质的C端或N端，通过利用组氨酸标 签和金属离子（镍离子、钴离子等）之间的亲和力分离/纯化目标蛋白质，能够容易地获得 尚纯度的目标蛋白。 然而用于纯化的亲和标签会对目标蛋白的活性和结构造成不利影响。为此，为了 生产用于蛋白质功能研宄和医学目的的目标蛋白，需要去除标签的过程。 本专利技术人（Bioneer)研制出自动化蛋白质合成系统ExiProgen?(韩国专利公开号 10-2011-0121588和10-2013-0023091)和相关的试剂盒。这个系统自动化地实施无细胞蛋 白质表达反应并纯化表达的蛋白质。在这个系统中，反应所需的模板DNA和溶液能够自动 化地混合以便自动化地实施蛋白质表达反应，并能够保持在合适的反应温度。并且，包括从 DNA合成RNA以及从RNA表达蛋白质在内的所有过程都能够保持在最佳温度。而且，为了容 易地从包括表达的蛋白质的混合样品中纯化目标蛋白，将亲和标签如寡聚组氨酸连接到目 标蛋白，目标蛋白以这样的状态表达，并利用连接有二价金属离子（镍离子、钴离子等）的 磁珠自动地纯化。上述ExiProgen?和试剂盒能够同时表达并纯化不同种类的蛋白质，但是 存在这样的问题，即因为蛋白质的表达是以批处理方式实施，随着时间的推移能量源耗尽， 蛋白质的表达被积累的蛋白质表达抑制剂终止，因此最终表达的蛋白质的水平低。 为了提高蛋白质表达水平，应连续不断地供应含有三磷酸核糖核酸、氨基酸、能量 源的小分子表达溶液，并去除蛋白质表达抑制剂。为了自动化地实施这些操作，需要新型反 应器和系统。 本专利技术人已经努力研制出一种系统和试剂盒，其能够克服自动化蛋白质合成器 ExiProgen?的蛋白质表达效率低的缺点，并且在消除因使用具有表达溶液体积10倍或者 更多量的小分子表达溶液引起的系统尺寸增加的需要同时，提高了目标蛋白的表达水平。 因此，本专利技术人已经研制了一种能提高目标蛋白表达水平的系统，其通过在无细胞蛋白质 表达反应过程中，经透析膜连续不断地供应小分子表达溶液，并去除蛋白质表达抑制剂来本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种自动化无细胞蛋白质生产系统，包括：包括反应容器的蛋白质表达反应单元，所述反应容器包含一个或多个透析管，每个透析管包含透析膜并且顶端开放；反应温度控制单元，配置为加热或冷却反应容器；吸液管阵列，包括一个或多个吸液管并且配置为利用所述吸液管吸取或排放溶液；吸液管阵列移动单元，配置为在上下方向、前后方向或左右方向移动吸液管阵列以移动溶液；蛋白质纯化单元，包括磁场施加装置；和多孔板安装单元，其中安装有多孔板试剂盒，所述多孔板试剂盒配置为提供用于蛋白质生产的溶液。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴翰语，金钟甲，韩指元，赵俞相，金敏贞，金荷娜，李洋源，金楠镒，
申请(专利权)人：株式会社百奥尼，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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