分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，公开了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。多肽选自：（1）SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列；和（2）在（1）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQIDNO：2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala，以及311位氨基酸残基为Ser，且具有脂肪酶活性的由（1）衍生的多肽。本发明专利技术得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。

【技术实现步骤摘要】
分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。
技术介绍
脂肪酶（三脂酰甘油酰基水解酶，EC3.1.1.3）是一类能在油水界面催化酯水解，转酯化和酯合成的酶。其被广泛地应用于化学，食品，制药和日化等工业中。比如：利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油，并且对皮革加工、造纸工业都有重要的帮助；脂肪酶另一个重要工业应用就是催化油脂改性，新的油脂可通过在甘油的Sn-1和Sn-3位上酰基交换获得。例如用价格便宜的棕榈油升级为类可可脂。其中来源于真菌米黑霉的脂肪酶RML（RhizomucormieheiLipase）就是一种能够专一性水解甘油三酯1,3位酯键的脂肪酶，得到的二酯和单酯在食品和商品业中都具有更广泛的应用价值。提高脂肪酶的催化活力，是降低脂肪酶生产成本的有效途径之一。而若同时提高脂肪酶的热稳定性，则使其在工业应用中更具有价值。本专利技术以具有1，3专一选择性的米黑根毛霉脂肪酶（RhizomucormieheiLipase）为研究对象，首先采用易错PCR定向进化技术，利用大肠杆菌表达体系，建立脂肪酶突变库，通过高通量筛选方法，筛选出热稳定性和酶催化比活提高的RML突变脂肪酶，将其相应的突变基因测序后，分析氨基酸突变位点，并针对这些位点进行定点饱和突变，以达到进一步提高脂肪酶催化比活力及耐热性的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时具有高热稳定性及对甘油三酯的高水解能力的脂肪酶突变基因，涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：多肽，所述多肽选自：（1）SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列；和（2）在（1）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQIDNO：2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala，以及311位氨基酸残基为Ser，且具有脂肪酶活性的由（1）衍生的多肽。作为优选，以SEQIDNO:2的氨基酸序列编号计，（2）所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第78位的Thr，第113位的Ser，第168位的Pro，第173位的Arg，第190位的Asn，第240位的Ser，和第313位的Asp。作为优选，以SEQIDNO:2的氨基酸序列编号计，（2）所述的多肽或者至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第67位的Asp，第240位的Ala（或240位的Val，或240位的His），第311位的Cys，第313位的His。多核苷酸，所述的多核苷酸选自：编码上述技术方案中任一所述的多肽的多核苷酸和与（1）所述的多核苷酸互补的多核苷酸。作为优选，所述的多核苷酸编码如SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽。作为优选，所述的多核苷酸的核苷序列如SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示。载体，所述的载体含上述技术方案中任一所述的多核苷酸。作为优选，所述的宿主细胞含有上述的载体，或含有上述技术方案中任一所述的多核苷酸。本专利技术由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本专利技术得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。附图说明图1是本专利技术考马斯亮蓝测蛋白浓度标准曲线。图2是PCR扩增RML基因结果。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。图3是RML基因成功克隆于载体pET30a的鉴定。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。图4是SDS-PAGE检测RML的表达；M:蛋白质Marker；Control:未加诱导剂的样品；1，加入IPTG诱导，取菌体离心后的上清为样品，检验是否有分泌表达；2，根据前述步骤，加入IPTG诱导，超声破碎菌体细胞得到样品。脂肪酶RML克隆于载体pET30a后，蛋白表达大小42kD，为胞内表达，而非分泌表达。如图中箭头指向。图5是SDS-PAGE检测RML纯化结果；蛋白大小42kD，如图中箭头指向。图6是野生型脂肪酶催化油脂反应释放的产物量随时间的变化，30分钟内通过酸碱滴定所释放的脂肪酸的量随时间增长成线性增长。图7是对硝基苯酚标准曲线。图8是易错PCR扩增结果。图9是定向进化提高脂肪酶活性和热稳定性的趋势图。图10是QuickChange法定点饱和突变氨基酸流程图。图11是QuickChange定点饱和突变PCR扩增结果。M:DNAMarker;脂肪酶RML全基因克隆于载体pET30a中，重组质粒全长6442bp，如图中箭头所示。图12是定点饱和突变技术持续提高脂肪酶活性和热稳定性趋势图。具体实施方式下面结合附图1至附图12与实施例对本专利技术作进一步详细描述：如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽”或“分离的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、丝状真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。在本专利技术中，术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽。该术语还包括具有脂肪酶功能的、SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：一个或多个（例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。优选所述变异形式包括一个或多个（例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个）保守性取代。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。应理解，对于本专利技术SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的变异形式，优选的是它们保留了本专利技术所特别指出的突变位点上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：（１）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０或２２所示氨基酸序列；和（２）在（１）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸序列编号记第４８位氨基酸残基为Ｖａｌ，６７位氨基酸残基为Ａｌａ，以及３１１位氨基酸残基为Ｓｅｒ，且具有脂肪酶活性的由（１）衍生的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽为SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列。2.多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸选自：编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸编码如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，王珏，王丹，王博，刘敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86