分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法技术

本发明专利技术提供式(I)化合物，其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或者R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及分析细胞或其它生物材料的方法，识别完整的和不完整的细胞的方法、所述方法的检测系统，以及涉及一些新的化合物和包括这些化合物和核酸的荧光复合物。本专利技术在细胞和其它生物材料的分析中具有广泛应用，尤其但不限于，涉及一种类型的不渗透细胞的荧光染料及其用途。用于测定样本的细胞浓度和活力的方法(包括在非固定的细胞样品中识别细胞完整性，以及在固定的和可渗透的细胞样品中染色核材料)常规用于生命科学和医疗工业中。鉴定与形态学、生物化学和分子变化(其倾向于、优先于以及伴随细胞死亡(例如坏死或凋亡))有关的过程的能力在生命科学具有广泛的关注。分子探针技术(其容易在流式细胞仪和显微镜平台上进行，允许在未接受先前固定的细胞样品中进行所述过程的细胞水平研究)尤其引起关注(Darzynkiewicz, Juan等.1997)。已经开发了多种基于突光染料的染色方案，用于流式细胞和显微分析真核细胞和细菌的活力。活/死细胞分析已经先前探索了完整的或代谢活性的细胞防止比色或荧光染料穿透至一个或多个细胞腔隙的能力。在高等真核生物中，该性质主要涉及质膜的完整性，而在低等真核生物、原核系统和植物中，细胞壁组成和破坏也可影响染料穿透和行为。已经公开了从活细胞状态至死细胞状态的过渡期，但其经常在不同类型的细胞和所涉及的过程的速度和形式之间存在差别。认为活的、完整的或有活力的细胞为如下细胞其同时保留一定程度的代谢功能和质膜完整性，但不必然意味着具有增殖能力。质膜完整性的丧失，而非其它膜重组的过程，是细胞死亡过程中的临界点，并且导致细胞在细胞的内环境与外环境之间显示增强的或自由的分子(根据它们的具体性质)通道的可能。在细胞死亡过程中，膜重组的实例表现为膜联蛋白V分子与细胞表面的结合增强，但是需要与膜联蛋白V与具有破裂的膜的细胞(所述细胞代表了与不渗透细胞的染料的正染色有关的细胞死亡晚期)的结合相区别。显示受损的膜完整性的细胞可以描述为无活力的或不完整的细胞，并且认为包括死的、可渗透的或死亡中的细胞，其显示了膜破裂的特征。该临界转变点可以通过不渗透活细胞的染料的进入增加得以鉴定，提供了细胞死亡的功能性定义和一种分析方法。优选地，所述染料具有结合至残留的细胞内结构的能力，因此优先蓄积在细胞群中的不完整的细胞内。应当理解，在细胞死亡过程中相对长期保留了携带残留核酸的结构，而细胞单位最终分解为多个碎片通常鉴定为残骸(debris)。活体染料也可用于检测和因此选择细胞群。这特别有利于需要保留活的、非受损的细胞的功能的分析。一种方法为通过检测活跃的细胞代谢正面评价活力，所述细胞代谢可以通过渗透细胞的非-荧光底物在细胞内转化为强荧光产物测定，所述强荧光产物优先保留在完整的细胞内(例如通过细胞内非-特异性酯酶活性的醋酸荧光素代谢)，因此正识别有活力的部分。在该情况下，排除具有受损的完整性的细胞用于增强来自所述分析的信息的有效性。另一方面，不渗透活细胞的染料将进入膜受损的细胞中，所述细胞为死细胞 或处于凋亡或细胞死亡的晚期。在不渗透细胞的DNA结合染料的情况下，染料进入和随后与细胞内残留的核酸的相互作用用于报道给定细胞的膜的受损状态。在该情况下，所述细胞内染料与残留的核酸(优选DNA)之间的‘复合物’为报道原理(reporting principle)。在该情况下，所述试剂不再被这些细胞排出，而且现在具有复合物形成的可及性，因此提供了对活力的负染色和对受损的细胞的正染色。应当理解，细胞样品也可使用固定方法处理，以允许细胞特征的分析作为生命科学中所用的大量技术的一部分。所述固定方法和细胞渗透方法可以改变，但经常导致允许不渗透活细胞的染料进入的膜改变。优选通过获取与染料高亲和力结合至细胞内核酸有关的荧光信号指示染料进入，并且常常认为染料进入得到结合后荧光增强协助。不定地结合至核酸的不渗透细胞的(和渗透细胞的)荧光染料为一大类分子探针，其广泛用于生物科学，并可容易地获自商品供应商。这些试剂的所寻求的特征包括核酸选择性、激发和发射特性、量子产率、结合后荧光增强的可能、在水性环境中的性能、从非 受损的细胞排出的程度(对活力提供负染色，并对细胞死亡提供正染色)或对于完整的细胞分析的穿透至完整的细胞的速度。具体染料的选择通常由与掺入分析的其它荧光团的光谱重叠程度以及对选择性或最佳激发方便的光源的可用性来确定。由于细胞死亡的过程常常包括细胞性质随扩展的期间时限(几分钟至几天)连续获得改变，因此有必要确保不渗透细胞的染料具有可忽略的毒性，使得给定染料的连续存在不会影响报道分析中活力的丧失。所述非-毒性的不渗透细胞的染料优选用于连续监测长期分析中的活力的丧失。众所周知，在具有变化的结构完整性水平的细胞中，细胞染色质被渗透和非-渗透染料突光染色的性质的程度复杂且不容易预测(Wlodkowic, Skommer等.2007)。发生细胞死亡过程的细胞(允许其它不渗透细胞的指示剂染料进入细胞)也发生了细胞结构变化(不仅是染色质构象)。经常观察到凋亡的细胞核被吸收阳离子染料深色染色，而对于许多DNA荧光染料凋亡的细胞核常常表现暗淡。目前的理解是，早期的凋亡细胞的染色质对阳离子染料的增强的亲和力与构象松弛而非DNA降解有关(Erenpreisa, Freivalds等.1997)。在晚期的凋亡细胞中，降解的DNA的非常致密的包装促进影响荧光性质的染料进一步聚集(Erenpreisa, Freivalds 等.1997)。靶向核酸的染料对细胞的荧光染色因此是细胞状态、渗透性质、染料结合特异性、染料结合方式以及染料-染料相互作用的复杂模型(complexmatrix)。为了在基于细胞的分析中消除该问题，常规方法已经倾向于高荧光增强和高量子产率的染料。在核酸染色中已经发现了大量不渗透细胞的染料的用途。最常使用的实例为碘化丙啶(PD。强荧光的PI信号具有检测简单和灵敏的优点，但当该荧光染料掺入多色分析中时具有缺点。另外，PI具有在UVA(例如365nm)波长和被蓝光(例如488nm)波长激发的能力，当有差别的激发用于区分荧光分析物或通过荧光探针检测的分析物时，其应用变得复杂。PI不具有用于方便分析细胞染色的比色特征。尤其是，在邻近分析PI的峰发射区域的可见光谱部分收集到的信号中，必须应用补偿，以解决I益出’。此外，PI的荧光发射可能处于以下光谱区域，在该区域中来自荧光分析物或者通过荧光探针检测的分析物的发射可能需要区分。PI提供了一些如同在红外区(red region)和之外区域(例如>620nm波长)发射的不渗透活细胞的染料的光谱优点。应当理解，结合至DNA的PI的高荧光强度经常需要以对数标度分析从细胞群中获得的荧光信号，其为鉴定细胞亚群提供了广阔的动态范围。US 5，057，413教导了使用渗透细胞的核酸染料LDS-751，其中基于发射出的荧光的量，对DNA的偏好区分了受损的和完整的细胞。在其它实例中，在白细胞标记(CD45)的表达的流式细胞的白血病/淋巴瘤评估中，使用染料7-AAD(具有低的完整细胞渗透性质)能够区分完整的和死的细胞，避免了非-特异性染色的缺陷(Shenkin，Babu等.2007)。在另一实例中，美国专利申请20070082377公开了使用不渗透细胞的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.09 GB 1005939.21.式⑴化合物2.权利要求I的化合物，其中XpX2和X3中至少一个为NR1-A-NR2R3R4+(Zm_)1/m。3.权利要求2的化合物，其中X2,而非X1和X3,为NR1-A-NR2R3R4+(Zm_) 1/m。4.上述权利要求中任一项的化合物，其中X1和X3均为羟基。5.权利要求I至3中任一项的化合物，其中X1和X3均为氢。6.上述权利要求中任一项的化合物，其中R1为氢。7.上述权利要求中任一项的化合物，其中R2、R3和R4为Cy烷基。8.权利要求7的化合物，其中R2、R3和R4为甲基。9.上述权利要求中任一项的化合物，其中A为(CH2)2。10.式(IA)化合物11.式(IB)化合物12.荧光复合物，其包含核酸和式(I)化合物13.权利要求12的复合物，其中所述核酸为DNA。14.权利要求13的复合物，其中所述DNA存在于细胞内。15.权利要求14的复合物，其中所述DNA存在于不完整的细胞内。16.一种分析细胞或含有核酸的其它生物材料的样品的方法，所述方法包括以下步骤 a)制备含有式(I)化合物的生物相容的溶液17.权利要求16的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发所述式(I)化合物，并检测放射出的荧光信号。18.权利要求16的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为色度性质。19.权利要求16至18中任一项的方法，其用于识别细胞样品中的细胞核，其中进行步骤b)以使得细胞核中的核酸被所述式(I)化合物结合，且细胞核的识别至少部分地基于步骤C)中检测的光谱学性质。20.权利要求16至19中任一项的方法，其中进行步骤b)以将细胞样品用式(I)化合物染色。21.权利要求20的方法，其中监测到细胞死亡增加，其中在测试期之前或期间进行步骤b)，因此使得在测试期期间连续或频繁地读出细胞死亡增加。22.权利要求17或从属于权利要求17的权利要求18至21中任一项的方法，其中步骤c)包括通过流式细胞仪检测个体细胞发射出的荧光。23.权利要求17或从属于权利要求17的权利要求18至21中任一项的方法，其中步骤c)包括通过荧光显微镜进行细胞内定位检测。24.权利要求16至23中任一项的方法，其用于分析固定的或渗透化处理的细胞，其中所述细胞的样品通过使用固定剂或渗透剂处理而固定。25.权利要求16至24中任一项的方法，其中步骤b)还包括用至少一种其它荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与该荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。26.权利要求25的方法，其用于识别完整的细胞和不完整的细胞，其中所述式(I)化合物不渗透细胞，步骤b)还包括用渗透细胞的第二荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在不完整的细胞相关联，且所述与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在完整的细胞相关联。27.权利要求26的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力，该结合能力低于式(I)化合物的结合能力，并因此在式(I)化合物的存在下，较不有效地竞争结合识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述第二荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被式(I)化合物掩蔽。28.权利要求26或权利要求27的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物为式(II)化合物29.权利要求28的方法，其中X2,而非X1和X3,为NR1-A-NR2R3030.权利要求26至29中任一项的方法，其中在将细胞样品暴露于为潜在毒性或者能够诱导细胞死亡的试剂后，进行完整的和不完整的细胞的识别，以监测所述试剂对细胞样品的影响。31.权利要求26至30中任一项的方法，其中步骤b)还包括使用至少第三荧光染料或发光化合物处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：PJ史密斯，RJ厄林顿，LH帕特森，
申请(专利权)人：生物状态有限公司，
类型：
国别省市：