测定细胞内环状核苷酸的浓度的测试方法技术

本发明专利技术涉及对细胞内环状核苷酸ｃＧＭＰ和ｃＡＭＰ的浓度进行定量光学分析的方法。所述的方法利用了以重组方式将特定ＣＮＧ通道、钙敏感的光蛋白和不同靶蛋白组合表达的细胞系，以找出调节物。以该方式修饰的细胞系适用于高通量筛选（ＨＴＳ和ｕＨＴＳ），并且可用于鉴别对参与环状核苷酸ｃＧＭＰ和ｃＡＭＰ的形成或分解的受体或酶的活性有影响的药物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对环状鸟嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cGMP)或环状的腺嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cAMP)的胞内浓度进行定量光学分析的方法。该方法可用于鉴别和评估对参与环状核苷酸cGMP和cAMP的生成和分解的受体或酶的活性有影响的测试物质的药理学特性。因此该方法适合用于获得例如可溶的和膜结合的鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶(PDE)、NO合成酶和G蛋白质耦合的受体(GPCR)的调节物。本专利技术描述了一种方法，该方法借助于重组细胞系对细胞内的cGMP或cAMP的浓度进行测量。所述细胞系通过将环状核昔酸活化的离子通道(CNG-通道)、一种钙敏感的光蛋白以及受体或酶组合一起重组表达，以便找到调节物。该方法适用于自动化，以及以高的或非常高的处理能力(″高通量筛选″(HTS)和″超高通量筛选″(uHTS))来寻找调节物。现有的测量cGMP或cAMP的胞内浓度的方法存在缺陷由于使用了放射性，非常昂贵，不能或只能部分地用于自动测量，并且非常昂贵。用于测定cGMP和cAMP的传统商业系统是放射性技术如″放射性免疫分析″(RIA；例如来自于IBL，Hamburg)，″闪烁接近分析法″(SPA；AmershamBioscience，UK)和非放射性的″酶联免疫吸附分析″(ELISA；例如来自于Amersham Bioscience，Uk)。上面描述的方法不能用于在活的细胞中“原位”测定cGMP和cAMP胞内浓度。在测量时必须将细胞破碎，并随后提取出环状核苷酸。另一种测量cAMP胞内浓度的方法是借助于诱导性的启动子系统(″cAMP-应答元件″，CRE)和荧光素酶(Goetz等人，J.Biomol.Screen.(2000)5377-384)进行测量。该方法的缺点是为了形成信号必须启动转录和转译，这导致测量过程持续几小时以上。因此不适于快速测量细胞中实际的cAMP浓度。本专利技术的任务是找到一种改进的非放射性的方法，用于测量细胞内cGMP或cAMP的浓度。该方法可以非常快速实施，并且有更高的灵敏性。该方法应当能够自动化并适合以高试样或测试化合物通量(HTS和uHTS)进行筛选。本专利技术范围内的测试化合物优选的是分子量为100到500，或者100到1000，或以上的小分子化合物。在本专利技术方法中可以是使用单一物质或其混合物。本专利技术范围内的测试化合物包括抗体、天然物质、天然物质的提取物、肽、蛋白质及核酸。上面所述只是为了举例说明，而不是穷举。为了建立酶和受体的筛选系统，以单一或不同组合的方式，将各种各样的对细胞内cAMP或cGMP水平有影响的由环状核苷酸活化的离子通道(CNG通道)转染到细胞中，所述的细胞另外还组合表达钙敏感的光蛋白。接着用各种各样的酶或受体转染所述细胞，以检测高通量筛选细胞的能力。在此例如使用可溶性的鸟苷酸环化酶，因为它在受刺激的情况下，能够形成胞内cGMP。例如β-肾上腺素能受体可用作为受体，其在活化之后，诱导胞内cAMP浓度上升。CNG通道是内在膜蛋白，它被环状核苷酸cGMP和cAMP打开。所述的离子通道家族包括能渗透钠、钾和钙离子的非选择性阳离子通道。功能性的通道是由四种相同的或不同的亚单位(同源或异源四聚体)形成的。不同的亚单位组合将影响其对cGMP和cAMP的敏感性(Biel等人，TCM(1996)6，274-280；Kaupp和Seifert，Physiol.Rev.(2002)82，769-824)。CNG1-CNG6的通道亚单位已被克隆和公开了，其最新的分类命名为CNGA1-CNGB3(Bradley等人，Science(2001)294，2095-2096)。还存在拼接变型，如CNG4.3(Sauter等人，PNAS(1998)95，4696-4701)。随着胞内cGMP或cAMP浓度的上升，CNG通道被打开，并且通过其流入钙离子。这时借助于钙敏感的荧光指示剂，如FURA，Fluo-3或借助于钙敏感的发光蛋白，如水母发光蛋白或奥贝林(Obelin)证实流入的钙离子。来源于水母(Aequorea victoria)的发光蛋白水母发光蛋白在细胞中是高敏感的钙指示剂。水母发光蛋白复合物由蛋白质Apoaequorin，分子氧和发光体腔肠素组成。在钙存在时(Ca2+-离子)复合物发出蓝光，在466nM处有最大发光量(Jones等人，Trends Biotechnol.(1999)17，477-481)。另一个发光蛋白是奥贝林，它是从不同的水螅纲如双叉薮枝(Obelialongissirna)克隆得到。它是由Apoobelin、O2和发光体腔肠素组成。钙存在时同样发出蓝光(Illarionov等人，Methods Enzymol.(2000)305，223-49)。鸟苷酸环化酶负责由GTP产生cGMP。可以分为可溶性的和膜结合的鸟苷酸环化酶。可溶性的鸟苷酸环化酶是一个来自于α和β亚单位的异源二聚体。其对于内皮NO合成酶制备的一氧化氮(NO)是天然的受体，因此可以借助于释放NO的物质如SIN-1活化其药理学特性。由于由鸟苷酸环化酶制备的cGMP诱导血管放松，所述的酶包括有高价值的药物学靶(Hobbs AJ.，TIPS(1997)18，484-491)。膜结合的具有跨膜蛋白的片段，被不同的激动剂如ANP、BNP、CNP或鸟苷蛋白活化(Wedel和Garbers，Annual Rev.Physiol.(2001)63，215-233)。另一个药物上有用的蛋白家族是所谓的G蛋白质结合的受体(GPCR)。它们是在细胞内具有胞外激素作用的内在膜蛋白。该受体与不同的G蛋白质的耦合，影响到细胞内cAMP或钙的水平。所谓的Gq耦合的受体的活化导致钙从内部存贮中释放，从而提高了细胞质中钙的浓度。所谓的Gs耦合的受体的活化导致cAMP浓度提高，所谓的Gi耦合的受体的活化却相反地导致胞内cAMP含量下降(Gurrath M.，Curr.Med.Chem.(2001)8，1605-1548)。Gs耦合的受体的一个例子是所谓的β-肾上腺素能受体，它借助于激动剂如异丙肾上腺素起刺激作用(Dzimiri N.，Pharmakol.Rev.(1999)51，465-501)。由鸟昔酸环化酶和GPCRs产生的环状核苷酸cGMP或cAMP被所谓的磷酸二酯酶(PDEs)水解为GMP或AMP。磷酸二酯酶构成了酶家族，基于物质特异性、在体内的调节和表达方式可清楚地区分其成员(Francis等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.(2001)65，1-52)。PDEs对胞内cAMP和cGMP水平的控制起着决定性的作用，并且也是药物学干扰的重要的靶。令人惊奇的是，CNG3-通道(SEQ ID NO5，Acc.No.X 89600)或者特别是CNG2通道(Seq ID Nr.1.Acc.No.X55010)与一种发光蛋白的组合，特别适合于检测胞内cGMP浓度的变化(附图1)。同样令人惊奇的是，CNG2/CNG4.3/CNG5(Seq ID Nr.1/Seq ID Nr.2，Acc.No.AJ000515/Seq ID Nr.3，Acc.No.U12623)与发光蛋白的组合可以非常好地适合检测胞内cAMP浓度的变本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定胞内环状核苷酸浓度的方法，其特征在于：ｉ）制备和使用一种细胞，该细胞将ＣＮＧ通道与发光蛋白一起表达，和ｉｉ）借助于发光蛋白的发光信号测定细胞内环状核苷酸的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F温德尔，
申请(专利权)人：拜耳医药保健股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]