用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法技术

用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，包括如下步骤：构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1-hGDNF；选用HEK293细胞作为工程细胞，利用细胞转染方法将pcDNA3.1-hGDNF导入所述HEK293细胞内，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞；用ELISA方法筛选出高产率稳定表达hGDNF的HEK293克隆细胞株作为生产hGDNF的工程株；在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液不断收集，并更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含hGDNF上清液；通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化。利用本发明专利技术生产的重组人胶质细胞源性神经营养因子糖基化程度和纯度均高于用原核细胞生产的同类产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种。
技术介绍
帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在> 65岁的人群中，1%患有此病，在> 40岁的人群中则为0.4%，本病也可在儿童期或青春期发病。白种人发病率最高，其次是黄种人。H)是一终身性疾病，迄今为止尚无根治的方法，一旦患病则需要终身治疗，由于手术治疗价格昂贵而且有严格的手术指征，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段，因而药物治疗仍是目前治疗H)的主要方法。胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha (GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。GFRots亚基靠其C端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，不能直接转导信号。GDNF首先与GFRa I受体结合形成⑶NF-GFRotI复合物，此复合物再与Ret结合形成三聚体复合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导，发挥GDNF的生理作用。体内外的许多实验研究均证明⑶NF可以促进中脑黑质多巴胺能神经元，颅神经和脊髓运动神经元，脑干的去甲肾上腺素能神经元，基底前脑胆碱能神经元，背根神经节，交感神经元的存活。⑶NF在这些不同环境中的表达对于其在神经变性性疾病研究及治疗有着重要的意义。直接将GDNF注入脑内到H)动物模型的黑质纹状体系统内，可改善这些模型动物的行为学症状 及其黑质纹状体系统多巴胺能神经元的存活率。所以，GDNF以H)为适应症，潜在的治疗对象还包括坐骨性神经痛、周围神经损伤后造成的慢性神经痛、其它神经退行性疾病以及男性生殖干细胞疾病，因此具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。但是，目前均采用大肠杆菌来表达生产GDNF，但是大肠杆菌作为原核细胞，其表达生产的⑶NF为人体所使用时，会产生抗体；同时，⑶NF的纯度以及糖基化程度均十分重要，因此急需一种。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，从而消除上述
技术介绍
中缺陷。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是:，包括如下步骤:S1、构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.Ι-h⑶NF ；S2、选用HEK293细胞作为工程细胞，利用Lipofectamine细胞转染方法将pcDNA3.Ι-h⑶NF导入所述HEK293细胞内，并用G418进行阳性转染细胞筛选，得到稳定表达hffl)NF 的 HEK293 细胞；S3、用ELISA方法筛选出高产率稳定表达h⑶NF的HEK293克隆细胞株作为生产hffl)NF的工程株；S4、蛋白质的生产，在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液收集，并每隔4天更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含h⑶NF上清液；S5、通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化，从而得到高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子(rh⑶NF)。作为一种改进，所述步骤SI中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶xho I和Not I将表达载体线性化，再用T4DNA连接酶把h⑶NF cDNA(用限制内切酶xho I和NotI双切后)连接至pcDNA3.1表达载体中，构建的表达质粒为pcDNA3.l_h⑶NF。作为一种改进，所述步骤S2中，细胞转染方法的具体步骤为:A、把2μ g pcDNA3.l_h⑶NF加入到110 μ I Opt i_MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 转染试剂)M 150 μ I Opt1-MEM 培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；`C、将步骤A和步骤B的液体混合,得到DNA-Lipofectamine混合物；D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25°C室温下放置30分钟；E、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；F、用2ml Opt1-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中；G、在37°C、5%C02 (体积浓度，下同)的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，加入新鲜配制的3ml DMEM培养液，在37°C、5%C02的细胞培养箱中培养24小时；H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用0.0lM PBS洗细胞一次，然后加入新鲜的、含有500 μ g/ml G418的DMEM培养液对已转染的细胞基因组中插入了 h⑶NF基因的阳性细胞进行筛选，两周后，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞。作为一种进一步的改进，所述步骤G、H的DMEM培养液中，还含有其中含有体积百分比为10%的胎牛血清、以及总量为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸。作为一种改进，所述步骤S3中，用ELISA方法对HEK293稳定细胞株克隆的上清液中hGDNF进行定量测定，筛选出高表达克隆细胞株利用无血清DMEM培养基和悬浮培养驯化，得到生产hffl)NF的HEK293工程株。上述ELISA方法即酶联免疫吸附测定法，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)②酶标记的抗原或抗体(标记物)③酶作用的底物(显色剂)。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。作为一种改进，所述步骤S4中，将生产h⑶NF的HEK293工程株在无血清DMEM培养基中悬浮培养12天，期间每4天收集一次上清液，并添加新鲜DMEM培养基；将收集的上清液合并后以1000转/分的转速离心10分钟；然后用0.45 μ m的过滤膜进行过滤，得到的滤液用0.5M NaOH调节至pH值为8.2，得到得到含hffl)NF上清液。作为一种改进，所述步骤S5中，离子交换层析法的步骤为:选用》(16/20层析柱(GE Healthcare)，先用1.5M的NaCl平衡液平衡所述XK 16/20层析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，调所述XK 16/20层析柱的pH值为8.2 ;将含h⑶NF上清液过柱，并利用0.59M 0.82M的NaCl溶液进行洗脱，得到含有h⑶NF的洗脱液。作为一种进一步的改进，所述离子交换层析法中，1.5M的NaCl平衡液中含有IOmM磷酸盐、5mM EDTA。作为一种改进，所述步骤S5中，凝胶过滤层析法的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1?hGDNF；S2、选用HEK293细胞作为工程细胞，利用Lipofectamine细胞转染方法将pcDNA3.1?hGDNF导入所述HEK293细胞内，并用G418进行阳性转染细胞筛选，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞；S3、用ELISA方法筛选出高产率稳定表达hGDNF的HEK293克隆细胞株作为生产hGDNF的工程株；S4、蛋白质的生产，在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液收集，并每隔2－3天更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含hGDNF上清液；S5、通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化，从而得到高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子。

【技术特征摘要】
1.用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于:包括如下步骤: 51、构建哺乳细胞表达质粒PCDNA3.Ι-h⑶NF ； 52、选用HEK293细胞作为工程细胞，利用Lipofectamine细胞转染方法将pcDNA3.Ι-h⑶NF导入所述HEK293细胞内，并用G418进行阳性转染细胞筛选，得到稳定表达hffl)NF 的 HEK293 细胞； 53、用ELISA方法筛选出高产率稳定表达h⑶NF的HEK293克隆细胞株作为生产h⑶NF的工程株； 54、蛋白质的生产，在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液收集，并每隔2— 3天更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含h⑶NF上清液； 55、通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化，从而得到高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子。2.如权利要求1所述的用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于:所述步骤SI中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶xho I和Not I将表达载体双切线性化，再用T4DNA连接酶把h⑶NF cDNA连接至pcDNA3.1表达载体中，构建的表达质粒为pcDNA3.l_h⑶NF。3.如权利要求2所述的用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于:所述步骤S2中，细胞转染方法的具体步骤为: A、把2 μ g pcDNA3.l_h⑶NF加入到110 μ I Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用; B、加15 μ I的Lipofectamine至150 μ I Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用； C、将步骤A和步骤B的液体混合,得到DNA-Lipofectamine混合物； D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25°C室温下放置30分钟； E、然后加320μ I Opt 1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀； F、用2ml Opt1-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中； G、在37°C、5%C02的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，加入新鲜配制的3mlDMEM培养液，在37°C、5%C02的细胞培养箱中培养24小时； H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用0.0lM PBS洗细胞一次，然后加入新鲜的、含有500 μ g/ml G418的DMEM培养液对已转染的细胞基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹杰，
申请(专利权)人：潍坊易思特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：