色氨酸拉链β‑发卡抗菌肽及其制备方法和与应用技术

本发明专利技术提供一种色氨酸拉链β‑发卡抗菌肽及其制备方法与应用。其序列如序列表SEQ ID No.1所示，制备方法以色氨酸拉链结构为模板，结合抗菌肽的氨基酸组成及结构特点，利用跨链的W‑W相互作用作为结构稳定因子，并将带电荷氨基酸赖氨酸和疏水性氨基酸色氨酸作为重复二元序列单元对称循环排列于β‑发卡的两臂，获得抗菌肽WK3，具有较高的抑菌活性与细胞选择性，治疗指数高达161.27。通过该方法设计的抗菌肽不需要二硫键绑定却具有极高的结构稳定性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，具备成为抗生素替代物的应用潜质，该抗菌肽活性较高而细胞毒性相对较低。

Tryptophan zipper beta hairpin antibacterial peptide and its preparation method and Application

The invention provides a tryptophan zipper beta hairpin preparation method and application of antibacterial peptide and its preparation. The sequence of SEQ ID sequence table No.1 shows, preparation method using tryptophan zipper structure as template, combined with the amino acid composition and structure characteristics of antibacterial peptides, using cross chain W W interaction as structural stability factor, and charged amino acid lysine and hydrophobic amino acid tryptophan repeat two yuan sequence symmetrical cycle arranged in beta issuing arms, to obtain antibacterial peptide WK3, antibacterial activity and cell has high selectivity, high therapeutic index was 161.27. The structural stability of antibacterial peptide designed by this method has high do not need two disulfide binding, enhance the selectivity of antibacterial peptide between bacterial cells and mammalian cells, have become a potential application of antibiotics substitutes, the antimicrobial activity was higher and lower toxicity.

【技术实现步骤摘要】
色氨酸拉链β-发卡抗菌肽及其制备方法和与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种色氨酸拉链β-发卡抗菌肽及其制备方法和与应用。
技术介绍
饲料工业的快速发展离不开抗生素类饲料添加剂所发挥的重要作用和贡献。但长期的过度使用甚至滥用抗生素导致了药物残留及耐药菌株在世界范围内普遍出现，对公共健康及环境安全造成了直接的威胁。抗菌肽具有抗菌活性高、无残留、易生产等特点，并且其不同于传统抗生素的抑菌机制使细菌不易产生耐药性，因此具备开发成为新一代抗菌药物的潜质。其中，β-发卡结构抗菌肽因其具有较高的抗菌活性和细胞选择性受到了人们的广泛关注。但目前对β-发卡结构抗菌肽的研究尚有不足，其主要原因是短肽很难形成稳定的β-发卡结构，通常需要一对以上的半胱氨酸形成分子内部二硫键使抗菌肽分子环化从而稳定其二级结构，这不仅增加了肽的合成难度与生产成本，而且二硫键易被生物体内含有巯醇基的物质所裂解导致其生物学活性的下降甚至丧失。因此，开发具有较高结构稳定性的线性β-发卡肽模式系统对于β-发卡抗菌肽的研究与应用具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种色氨酸拉链β-发卡抗菌肽及其制备方法和与应用；该抗菌肽不需要二硫键绑定但却具有稳定的β-发卡结构；该抗菌肽活性较高而细胞毒性相对较低。本专利技术的目的通过如下技术实现：一种色氨酸拉链β-发卡型抗菌肽WK3，序列如序列表SEQIDNo.1所示。本专利技术还具有如下技术特征：1、一种色氨酸拉链β-发卡型抗菌肽WK3的制备方法，包括如下步骤：(1)以色氨酸拉链结构为模板，结合抗菌肽的氨基酸组成及结构特点，将输水性的色氨酸W成对的排布于发卡两臂的非氢键形成位点上使之形成跨链的W-W相互作用从而稳定β-发卡结构，将带有正电荷的赖氨酸布置于氢键形成位点上使抗菌肽呈阳离子性，设计得到了线性的色氨酸拉链β-发卡抗菌肽：(WK)nDPG(KW)n-NH2；当n＝3时，抗菌肽命名为WK3，序列如序列表SEQIDNo.1所示；(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽WK3；(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽WK3的制备。2、如上所述的一种色氨酸拉链β-发卡型抗菌肽WK3，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现WK3不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌五种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。综上所述，WK3是一种具有较高应用价值的抗菌肽。附图说明图1为抗菌肽WK3的分子结构图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1抗菌肽的分子设计按照图1的分子结构，将输水性的色氨酸W成对的排布于发卡两臂的非氢键形成位点上使之形成跨链的W-W相互作用从而稳定β-发卡结构，选用正电荷的赖氨酸K布置于氢键形成位点上使抗菌肽呈阳离子性，这样以WK和KW为重复单位成对地延伸发卡两臂长度，设计得到了WK系列抗菌肽：(WK)nDPG(KW)n-NH2，n＝2，3，4；当n＝2时，抗菌肽命名为WK2；当n＝3时，抗菌肽命名为WK3，当n＝4时，抗菌肽命名为WK4。其氨基酸序列如表1所示。表1衍生肽的氨基酸序列将WK2、WK3、WK4三条肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。实施例2固相化学合成法合成WK2、WK3和WK4三条抗菌肽1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，实测分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。实施例3抗菌肽抗菌活性的测定1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果如表2所示。表2抗菌肽的抑菌活性通过表2可以看出，WK2、WK3和WK4对于革兰氏阴性和阳性菌表现出不同层度的抑菌活性，并且WK3和WK4抑菌活性显著高于WK2，说明抗菌肽的抑菌活性随循环次数增加而提高。2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mLPBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果如表3所示。表3抗菌肽溶血活性的测定通过表3可以看出，WK2和WK3在检测范围内未表现出溶血活性，而WK4在8μM浓度时引起的溶血率已经超过5％，说明随肽链长度的增加溶血活性显著提高。以上结果显示，在抗菌肽中随着WK或KW增加对称末端长度，其抗菌活性及溶血均有不同程度的升高。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，WK3具有最高的治疗指数，表明设计得到的WK3抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。<110>东本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种色氨酸拉链β‑发卡型抗菌肽WK3，其特征在于，序列如序列表SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种色氨酸拉链β-发卡型抗菌肽WK3，其特征在于，序列如序列表SEQIDNo.1所示。2.一种色氨酸拉链β-发卡型抗菌肽WK3的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以色氨酸拉链结构为模板，结合抗菌肽的氨基酸组成及结构特点，将输水性的色氨酸W成对的排布于发卡两臂的非氢键形成位点上使之形成跨链的W-W相互作用从而稳定β-发卡结构，将带有正电荷的赖氨酸布置于氢键形成位点上使抗菌肽呈阳离子性，设计得到了线性的色氨酸拉链...

【专利技术属性】
技术研发人员：单安山，徐林，丑淑丽，马清泉，董娜，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23