本发明专利技术公开了一种MicroRNA表达检测方法及其定量检测试剂盒。该方法包括：（1）提取样品的MicroRNA，将该MicroRNA连接PolyA尾巴；（2）将三条具有茎环结构的引物混合后退火处理，（3）将连有PolyA尾巴的MicroRNA与具有茎环结构的引物退火连接，（4）以该MicroRNA为模板反转录得到cDNA，（5）以该cDNA为模板，加入扩增目标MicroRNA的引物，通过荧光定量PCR方法检测目标MicroRNA表达。所述方法通过一次反转录可得到待测对象所有的MicroRNA及内参基因，大大降低了引物二聚体以及复杂发卡结构的生成，大幅度提高了对MicroRNA的检测效率。
Micro RNA expression detection method and quantitative detection reagent kit thereof
The invention discloses a method for detecting MicroRNA expression and a quantitative detection reagent kit thereof. The method comprises the following steps: (1) extraction of sample MicroRNA, the MicroRNA connection PolyA tail; (2) three with stem loop primer mixture after annealing treatment, (3) will be connected with the MicroRNA connection with the PolyA tail with stem loop primer annealing, (4) with the MicroRNA as template reverse transcription cDNA (5), with the cDNA as template, amplified primers join the target of MicroRNA by fluorescent quantitative PCR method to detect the expression of MicroRNA target. The method can be obtained through a reverse transcription of an object to be measured all MicroRNA and reference gene, two primer dimer and greatly reduces the generation of complex hairpin structure, greatly improve the detection efficiency of MicroRNA.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒。
技术介绍
Micro RNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链RNA，长度为21 25nt的短序列，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控(O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al.e-Myc-regulated microRNAsmodulate E2F1 expression .Nature, 2005, 4 (7043): 839.) 由于 Micro RNA 序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为Micro RNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明Micro RNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现Micro RNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现Micro RNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关(M eltzer PS.Cancer genemics:Small RNAs with bigimpacts.Nature, 2005, 435(7043):745.)。由于Micro RNA分子只有20_25nt左右大小，检测较为困难。以前主要采用的方法是Northern blot等杂交的方法进行检测,方法繁琐,不易成功,且Micro RNA极易降解，对于结果影响也较大。为了克服之前检测方法的缺陷，Allawi等建立了 Invader Assay的方法(AllawiHT, Deahlberg JE, OlsonS, et al.Quantitation of Micro RNAs using a modifiedInvader assay.RNA, 2004, 10:1153-1161), Liu 等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C, CalmnGA, et al.An oligo nucleotide microchipfor genome-wide micro RNA profiling inhuman and mouse tissues.PNAS, 2004,101 (26):9740-9744),这种方法提高了检测的敏感性及实用性，但这种方法需要荧光标记和荧光仪或芯片检测仪，而且由于micro RNA分子太小，应用也受到一定的限制。如今,对Micro RNA前体的检测主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD, JiangJ, Liu Q, et al.A high-throughput method to monitor the expression of Micro RNAprecursors.Nucleic Acids Research.2004,32(4):e43),米用随机引物或与 Micro RNA前体互补的引物直接进行反转录，但是这仅仅只能针对特异的Micro RNA，而且半定量的方法不能准确地表现出Micro RNA的表达量，所以该方法已经渐渐退出了 Micro RNA分子的检测的行列。上述方法在反转录Micro RNA时都显得过于繁琐且效率不高，于是出现了一种“加尾法”，即在Micro RNA的3’末端进行延长并采用real-time PCR的方法对Micro RNA进行检测。常见的加尾法有两种:一种是通过末端转移酶在Micro RNA分子的3'末端加上Poly-A尾巴(Shi R, Chiang V L.Facile means for quantifying Micro RNA expressionby real-time PCR.BioTechniques, 2005，39 (4): 519-525.)，用 30 40 个核苷酸的Oligo-dT作为引物进行反转录得到被延长的cDNA，可以使用SYBR Green进行实时定量PCR检测；另一种是直接使用与Micro RNA末端配对的加长引物反转录成cDNA，而后使用LNA修饰的引物通过Real-time PCR法对Micro RNA的表达情况进行检测(RaymondC K, Roberts B S, Garrett—engele P.et al, Simple quantitative primer—extensionPCR for direct monitoring of Micro RNA and short-1nterfering RNAs.RNA, 2005.11(11):1737-1744.)。然而这两种方法中，随机加尾法合成出来的cDNA对于PCR而言相对过短，只适合使用探针的taq man法检测,而加特异性micro RNA末端配对尾部的方法，只能合成Micro RNA特异性的cDNA,无法与内参同时反转,可能造成较大的误差。为了更高效地检测Micro RNA的表达量，并提高准确性，Chen等(Chen C，RidzonD A, Broomer A J, et al.Realtime quantification of micro RNAs by stem-loopRT-PCR.Nucleic Acids Res, 2005，33(20): 179.)在特异性 micro RNA 末端配对的加长引物反转录的基础上，将r eal time PCR技术引入到micro RNA的检测当中，建立了名为莖环的反转录定量PCR技术(stem-loop RT-PCR)0他首先设计了一个具有莖环结构的反转录的探针，然后采用Taq man的探针技术，对Micro RNA进行检测，据报道这种结构大大提高了 Micro RNA反转录的效率和特异性。但是这样高特异性的同时也导致了一次反转只能反转录出特异的一条Micro RNA，对于检测整体的Micro RNA及其他小片段RNA的表达状况来说是一种极大的制约，同时使用Taqman探针的方法也大大提高了 Micro RNA的检测成本。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对Micro RNA分子表达检测较为困难，现有的检测方法步骤繁琐、不易成功，并且所得Micro RNA极易降解，对结果有较大影响的缺陷，提供一种Micro RNA表达检测方法以及一种Micro RNA定量检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一是:一种Micro RNA表达检测方法，其中所述方法包括:(I)提取样品的Micro RNA,将所得Micro RNA连接PolyA尾巴；(2)将三条具有茎环结构的引物混合后进行退火处理，所述具有茎环结构的引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:3所示;(3)将步骤(I)所得连有Poly A尾巴的Micro RNA与步骤(2)所得具有茎环结构的引物退火连接；(4)以步骤(3)所得Micro RNA为模板反转录得到cDNA ；(5)以步骤(4)所得cDNA为模板，加入扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Micro?RNA表达检测方法，其特征在于，所述Micro?RNA表达检测方法包括以下步骤：（1）提取样品的Micro?RNA，将所得Micro?RNA连接PolyA尾巴；（2）将三条具有茎环结构的引物混合后进行退火处理，所述具有茎环结构的引物的序列分别如序列表中SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?IDNO:3所示；（3）将步骤（1）所得连有Poly?A尾巴的Micro?RNA与步骤（2）所得具有茎环结构的引物退火连接；（4）以步骤（3）所得Micro?RNA为模板反转录得到cDNA；（5）以步骤（4）所得cDNA为模板，加入扩增目标Micro?RNA的引物，通过荧光定量PCR方法检测目标Micro?RNA的表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚远颋，王海峰，费倩岚，谈竹君，劳昕元，
申请(专利权)人：上海黄离生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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