本发明专利技术公开了一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒。本发明专利技术的试剂盒根据MTHFR基因序列设计FRET特异识别探针对，可以针对MTHFR基因多态性C677T位点特异识别，当多态性位点为野生纯合型CC型时，溶解曲线Tm值为：64.5±1℃，当多态性位点为突变纯合型TT型时，溶解曲线Tm值为：56±1℃，当多态性位点为杂合型CT型时，溶解曲线有两个熔解峰，Tm值为：56±1℃和64.5±1℃。本发明专利技术检测试剂盒不仅特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简易，避免了开管操作带来的污染，而且通过检测仪器可以直观判断基因型。
Detection kit for MTHFRD gene polymorphism C677T
The invention discloses a detection kit for MTHFRD gene polymorphism C677T. The kit of the invention according to MTHFR gene sequence specific recognition probe of FRET design, can according to the polymorphism of MTHFR gene C677T locus specific identification, when the polymorphic loci were homozygous wild type CC, the dissolution curves Tm value: 64.5 + 1 C, when the polymorphic loci were homozygous mutation type TT. The dissolution curve of Tm value: 56 + 1 C, when the polymorphic loci were heterozygous for CT, dissolved curves have two melting peaks, the Tm value is: 56 + 1 and 64.5 + 1 DEG C. The detection kit of the invention has the advantages of good specificity, high sensitivity, low cost and simple operation, and avoids the pollution caused by the opening operation.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸检测领域，涉及采用基于荧光能量传递技术(fluorescenceresonance energy transfer, FRET)的实时突光 PCR 技术检测 MTHFR 基因多态性(C677T)的方法及试剂盒。
技术介绍
叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。其次，孕妇经常补充叶酸，可防止新生儿体重过轻、早产以及婴儿腭裂(兔唇)等先天性畸形。但是适应物极必反的原则，叶酸也不能滥补，长期服用叶酸会干扰孕妈妈的锌代谢，锌一旦摄入不足，就会影响胎儿的发育。人类基因组DNA中5，10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶，能催化5，10亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，而后者为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸的甲基供体。MTHFR基因677位单核苷酸多态性(C677T)导致第222位丙氨酸被缬氨酸替代，影响酶的催化结构域，形成热不稳定的蛋白质，酶活性降低约70%。从而引起叶酸代谢障碍，引发多种疾病，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。检测MTHFR基因型，可以提示脑卒中风险性，同时还能指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合征、唇腭裂、神经管 缺陷等新生儿缺陷。在中国人中，高达17%-47%的人为MTHFR基因异常人群。MTHFR基因正常的人，摄入的叶酸能够在体内顺利代谢，降低高同型半胱氨酸的水平。这类人脑中风、冠心病和静脉血栓的发病风险较低。MTHFR基因异常的人，摄入的叶酸在体内的代谢途径受阻，可能引起高同型半胱氨酸血症，导致凝血倾向增高，因此发生脑中风、冠心病以及静脉血栓的风险也增高。我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于=MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率。MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，对叶酸代谢造成障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高。对于这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。所以对MTHFR基因的检测在临床意义上具有重大的作用。目前MTHFR基因多态性(C677T)检测方法有以下几种:首先是作为“金标准”的基因测序，具有较高的特异性，并且能够大通量地检测，但是因为测序仪器很昂贵，没有办法普及，如果通过第三方服务来进行检测，则需要较高的时间成本，标本的保存与运输也是一种挑战。基于分子水平，迄今国内外报道对MTHFR基因的检测方法大都是采用PCR-RFLP，此方法以来限制性内切酶消化，电泳分析，酶切不完全往往被误判为杂合子，因为PCR产物要进行开管操作，容易形成气溶胶，导致假阳性的产生。电泳分析需要制备聚丙烯酰胺凝胶，EB染色，费时费力，并且有化学性危害。日前有采用MGB探针的方法，此方法能够避免开盖污染，具有较强的特异性，但是MGB探针的合成要求较高，国内只有数家公司可以合成，并且价格昂贵不适合常规的检查。
技术实现思路
本专利技术的目的即在于克服
技术介绍
的以上缺陷，提供一种PCR-FRET法的检测试剂盒，以对MTHFR基因多态性(C677T)进行检测。本专利技术的技术方案如下:一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，包括如下的引物对:MTHFR-F:5，-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’MTHFR-R: 5，-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3 ’一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，根据MTHFR基因序列设计FRET特异识别探针对，可以针对MTHFR基因多态性C677T位点特异识别，当多态性位点为野生纯合型CC型时，溶解曲线Tm值为:64.5 ± I °C，当多态性位点为突变纯合型TT型时，溶解曲线Tm值为:56±1°C，当多态性位点为杂合型CT型时，溶解曲线有两个熔解峰，Tm值为:56±1°C和64.5± 1°C。FRET特异识别探针序列如下:MTHFR-AP:FAM-5’ -GATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-3 ’ MTHFR-SP: 5，-CAGCCTCAAAGAAAAGCTGCG-3，-ROX所述的试剂盒中，包括:反应体系(PCR Mix):75mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20mmol/L (NH4) 2S04,0.01%Tween 20，50mmol/L KCl，2mmol/L Mg2+, 3.0mmol/L dNTP 溶液，0.5 μ mol/L MTHFR-F，0.05 μ mol/L MTHFR-R, 0.25 μ mol/L MTHFR-AP，0.2 μ mo I/LMTHFR-SP。酶液包含:5υ/μ I Taq HS ;阴性对照:灭菌超纯水。PCR-RFLP的原理，是分别设计一对特异引物和一对FRET探针。特异引物用来扩增目标序列，FRET探针作为目标序列的检测信号。FRET探针是依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3’末端有一个供体基团，下游探针在5’末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET探针可以进行溶解曲线分析，通过熔解曲线，可以判断出MTHFR基因多态性(C677T)。本专利技术采用PCR-FRET法进行检测，不仅特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简易，避免了开管操作带来的污染，而且通过检测仪器可以直观判断基因型。附图说明图1为本专利技术实施例2的结果图。具体实施例方式实施例1本专利技术共检测了 106份人类基因组样本，均由厦门市妇幼保健院提供。血液样本基因组提取，采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒提取，详细操作步骤如下:1、处理血液材料(已添加抗凝剂的血液样本100 μ 1-lml):a.当血液样品体积小于200 μ I时，可加缓冲液GS补足体积至200 μ 1，再进行下一步实验(如血液样品体积为200μ 1，可直接进行下一步实验，不需要加入GS)。b.当血液样品体积超过200 μ I时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下:在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL,颠倒混勻，IOOOOrpm ( 11500Xg)离心Imin,吸去上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200 μ I缓冲液G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，包括如下的引物对：MTHFR?F：5’?TCATCCCTCGCCTTGAACAG?3’MTHFR?R：5’?CTCAGCGAACTCAGCACTCC?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王顺旺，王小波，许文勇，叶水龙，
申请(专利权)人：厦门市第三医院，王顺旺，
类型：发明
国别省市：
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