本发明专利技术公开了一种基于基因组RAPD分析的紫山药品种分子鉴定的方法，包括以下步骤：1)取样及样品处理；2）DNA提取及其纯度和浓度检测；3）引物筛选和RAPD分析；4）使用引物S1255得到8种紫山药常规品系的标准图谱；5)将待鉴定的紫山药新品种按照上述步骤进行分析，得到所需要鉴定紫山药新品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱比较鉴定，可以判断不同的紫山药品种，具有快速、稳定、费用低的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于基因组RAPD (随机扩增多态性DNA标记，random amplifiedpolymorphic DNA)分析的紫山药品种分子鉴定方法,属于植物品种分子鉴定
技术介绍
紫山药薯蓣科薯蓣属植物，作为菜用的植物在我国主要为山药和大薯，大薯原产于亚洲热带地区，我国也是其原产地之一。最早记载有薯蓣的我国最早的一部药物学著作“神农本草经”中对山药就有记载，被列为上品，可药食兼用的材料。在此部书中，并未区分山药和大薯，将它们统称为薯蓣。后来因经历唐和宋两朝避讳帝王的讳而改成山药。到明李时珍的“本草纲目”中仍然没有明确的将两种植物分开，仍然统称山药。目前，世界上大薯的种植地主要在西非、东南亚等地。是西非等国的主要粮菜兼用的植物。在我国南方多省，没有大规模的种植基地，因其外形差，市场销量低，以一家一户，自产自销为主。大薯中有白肉和紫肉品种，紫肉品种是近几年因花青素的功效为大家所熟知而逐渐增加。紫山药(紫肉大薯)作为一种新兴的蔬菜资源，对其研究还很有限。先期进行的一些研究表明，紫山药同怀山药在营养成分及部分功能成分上接近甚至高于怀山药。表明紫山药有潜在的开发价值，既可作为蔬菜来食用，又可以像怀山药作为一种温和的药材。紫山药品种大都是地方品种，虽然南方部分地区少量种植，但栽培历史悠久。种植地区大都丘陵山坡地带，种植土壤土层深厚，质地疏松，有机质含量高，保水、保肥能力强，pH值为4.5-6.5，呈微酸性。紫山药因其肉质红中带紫而得名。紫山药块茎肥大，单个块茎重500克左右，最大达到2500多克，肉质柔滑，风味独特，色泽亮丽鲜美，营养丰富、肉质、色泽、味道、黏度、气味、口感、营养成份分析等商品化指标在全省、全国的山药中首屈一指。紫山药的药用价值很高，既可作餐桌上的佳肴，又可作保健药材，据《本草纲目》记载，经常食用紫山药，可以降低血压、血糖、抗衰益寿、健脑补智、增强人体免疫力和改善性功能，是益于脾、肺、肾功能的珍贵药食兼用资源。随着人们对紫山药的日益关注，同时也激起了农民对紫山药的种植热情，南方种植紫山药的品种也有多种，都统称为紫山药，从形态上很难准确鉴别，因此快速准确地鉴别紫山药品种是急需解决的问题。研究表明紫山药品种之间在分子水平上存在着显著差异，从DNA水平上直接检测其差异，并用于无性系品种的鉴别最为可靠。因此，对紫山药进行遗传分析具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于基因组RAPD分析的紫山药常规品种分子鉴定方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术 方案:一种基于基因组RAro分析的紫山药品种分子鉴定的方法，包括以下步骤:I)取样及样品处理；采用正常生长的紫山药品种，每个品种10株，每株10片新鲜幼叶放入冰盒，置于_40°C超低温冰箱中储存24h后冷冻干燥成粉末状，将其充分混匀；2 ) DNA提取及其纯度和浓度监测:以幼叶干粉为材料，取0.2g,采用2 X CTAB提取总DNA，使用0.8w%琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；3 )引物筛选和RAPD分析:在对紫山药进行RAPD分析的PCR扩增体系优化后，选取8个以上在形态上差异比较大的紫山药品种进行RAro引物筛选，筛选出I个扩增带清晰、多态性明显、重复性好的引物 S1255，其核苷酸序列·为 TGACGCACGG，进行 PCR 扩增，在 Gene Amp PCR System 9700PCR扩增仪上进行DNA扩增；4)扩增产物用含lv%Golden view的1.6w%琼脂糖凝胶电泳分离2_3h,电压为6V/cm;在UV光下检测扩增结果并通过凝胶成像系统(Gel Doc XR+)照相，得到8个以上紫山药品种的随机扩增多态DNA标准图谱(S1255引物扩增出的特有DNA指纹)；5)将待鉴定的紫山药品种按照上述步骤进行分析，得到待鉴定紫山药品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱进行比较判定，判断其是否为某种紫山药品种。上述方法中，所述DNA提取的方法为:(I)取6ml预热到60°C的2XCTAB溶液于装有叶片粉末的离心管中，60°C水浴30分钟，间或轻摇几次，使粉末和溶液混匀；(2)取出离心管，待冷却后加入6ml氯仿-异戊醇(体积比24:1)，置于摇床上30分钟充分混匀；(3) 12000rpm 离心 10 分钟；(4)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积预冷(_20°C)无水乙醇，混匀，在-20°C冰箱中放30分钟，使核酸沉淀成絮状；(5)室温下12000rpm离心10分钟；(6)弃上清，DNA沉淀风干后，溶解于800iil去离子水中，作为PCR模板DNA，_20°C保存备用。2 X CTAB的配制方法:Tris-HCl (pH8.0) 100mmol/L，EDTA-Na2 (EDTA 二钠)(pH8.0) 20mmol/L，NaCl1.4mol/L, CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)2w% (20g/L) ；DNA提取前加入0.2v% P -巯基乙醇。使用0.8w%琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度。测得DNA浓度大于10mg/ml，0D260/280的比值在1.8-2.0之间，0D260/230的比值在2.0-2.5之间。步骤3 )中，对紫山药进行RAPD分析的PCR扩增体系优化是指对DNA模板量进行优化；如对DNA模板量从5ng, IOng, 20ng, 40ng, 60ng, 80ng, IOOng进行优化,最终选择20ng。所述的PCR扩增的方法为:采用20 ii L反应体系进行PCR扩增，反应体系总体积为20 ii L，含 IOii L2 X EasyTag PCR SuperMix (+dye)(北京全式金生物技术有限公司)+2 ii L1OmM 引物 +20ng DNA。所述的PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min 30s ;接着94°C变性Imin 30s，40°C复性lmin，72°C延伸2min，40个循环；最后72°C后延伸lOmin。本专利技术基于基因组RAPD分析的8种以上紫山药常规品种分子鉴定方法，通过I)取样及样品处理；2) DNA提取及其纯度和浓度检测；3)引物筛选和RAPD分析；4)使用引物S1255 (上海生工生物工程有限公司)得到8种紫山药常规品系的标准图谱；5)将待鉴定的紫山药新品种按照上述步骤进行分析，得到所需要鉴定紫山药新品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱比较鉴定，可以判断不同的紫山药品种，具有快速、稳定、费用低的特点。本专利技术对紫山药栽培品种，特别是新选育紫山药品种进行DNA指纹分析，建立品种DNA指纹图谱，寻找特异DNA片段序列，以探索利用分子标记技术进行品种快速鉴定的方法，为紫山药栽培品种的快速准确鉴定及紫山药杂交优良亲本的预选提供理论依据。附图说明图1是8个紫山药品种采用引物S1255 (TGACGCACGG)扩增的RAPD标准图谱。图2是8个紫山药品种及待鉴定紫山药采用引物S1255(TGACGCACGG)扩增的RAPD图谱。具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本专利技术进行详细说明。一、材料与方法1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于基因组RAPD分析的紫山药品种分子鉴定的方法，包括以下步骤：1）取样及样品处理；采用正常生长的紫山药品种，每个品种10株，每株10片新鲜幼叶放入冰盒，置于?40℃超低温冰箱中储存24h后冷冻干燥成粉末状，将其充分混匀；2）DNA提取及其纯度和浓度监测：以幼叶干粉为材料，取0.2g，采用2×CTAB提取总DNA，使用0.8w%琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；3）引物筛选和RAPD分析：在对紫山药进行RAPD分析的PCR扩增体系优化后，选取8个以上在形态上差异比较大的紫山药品种进行RAPD引物筛选，筛选出引物S1255，其核苷酸序列为TGACGCACGG，在Gene?Amp?PCR?System9700PCR扩增仪上进行DNA扩增；4）扩增产物用含1v%Golden?view的1.6w%琼脂糖凝胶电泳分离2?3h，电压为6V/cm；在UV光下检测扩增结果并通过凝胶成像系统照相，得到8种以上紫山药的随机扩增多态DNA标准图谱；5）将待鉴定的紫山药品种按照上述步骤进行分析，得到待鉴定紫山药品种的随机扩增多态DNA图谱，将此随机扩增多态DNA图谱与标准图谱进行比较判定，判断其是否为某种紫山药品种。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庞源，宋曙辉，赵泓，王慧杰，何伟明，王文琪，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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