本发明专利技术公开了白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用，属于分子生物学和免疫学领域。本发明专利技术是将分子生物学的聚合酶链式反应技术和免疫层析技术进行结合，实现对白色念珠菌的快速检测。本发明专利技术试剂盒包括PCR扩增及试纸条检测共二部分。其中通过对引物进行特定修饰，并在试纸条制备中选择相应的包被物和标记物，反应过程中形成一个特异的复合物，实现分子生物学技术和免疫层析技术的结合，达到对白色念珠菌特异扩增产物的检测，与传统生化方法相比大大节省了检测时间，简化操作步骤，以达到快速、高效、准确的检测和筛选目的。在临床检测和筛选白色念珠菌的过程中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和免疫学领域，涉及快速检测白色念珠菌的试剂盒及方法和应用。
技术介绍
白色念珠菌(Candida albicans)是念珠菌属(假丝酵母属)中最为常见的种。也是临床上浅部/深部真菌病中发病率最高的念珠菌病的重要病原菌。由于该菌多侵犯已患有严重疾病机体免疫力低下的病人，以及接受器官移植，实施心脏、胃肠道手术需行插管、尿管、导管的外科病人，对生命威胁极大，为及早发现与诊断念珠菌感染，快速、简便、特异及准确达到临床分离和鉴定念珠菌的方法一直受到国内外的广泛关注。随着免疫受损或低下人群的不断扩大，机会性念珠菌病继续增多，迄今仍是医学真菌领域研究的热点。目前国内外白色念珠菌主要的检测方法有传统的微生物检测方法和分子生物学检测方法。微生物方法检测白色念珠菌主要用到科玛嘉显色培养基进行分离鉴别，要求检测人员有较丰富的经验，进口的培养基检测成本也高。分子生物学检测主要使用PCR及RT-PCR等方法，普通的PCR技术其扩增产物大多通过凝胶电泳判断扩增结果，该方法中的致癌物质不仅对环境和操作人员有很大的危害，而且要求检测人员具备熟练的操作技巧，点样时操作误差会使样品漂移造成结果不准确，不适合进行大量样本的检测分析工作；RT-PCR方法需要购买高端的仪器设备，并且试剂价格昂贵，这些都给检测带来了巨大的成本压力。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用；专利技术主要目的在于克服传统的微生物检测方法存在检测时间长、步骤繁琐等缺陷，提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。本专利技术设计试剂盒即可以保证PCR技术的灵敏度和特异性，还保留了免疫层析技术所具备的高效、便捷、低成本等特点。所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液、样品稀释液、阴性对照、阳性对照和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成。所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线；所述PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA 3’，下游引物R为5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG 3’ ；所述上游引物F标记生物素，下游引物R标记地高辛。所述结合垫上包被的胶体金颗粒粒径为25nm，ImL胶体金颗粒标记8.4 μ g鼠抗地高辛抗体，形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL,包被量为I μ L/cm ;控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL，包被量为I μ L/cm。PCR反应液组成如下:23 μ L反应体系包括以下组分权利要求1.一种白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成；其特征在于试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA3’，下游引物 R 为 5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG3’ ；所述上游引物 F5 ’端标记生物素，下游引物R5’端标记地高辛；所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线。2.如权利要求1所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液组成如下:23 μ L反应体系包括以下组分3.如权利要求1或2所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，所述PCR反应液中引物F5’端标记的生物素与硝酸纤维素膜上亲和素结合；引物R5’端标记的地高辛与结合垫上胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体结合。4.如权利要求1或3所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述结合垫上包被胶体金颗粒粒径为25nm, ImL胶体金颗粒标记8.4 μ g鼠抗地高辛抗体,形成的胶体金-抗体复合物在结合点垫上的包被量为2mL/30cm。5.如权利要求1所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜上检测线包被亲和素浓度为0.5mg/mL，包被量为I μ L/cm ;控制线上包被羊抗鼠抗体浓度为lmg/mL,包被量为I μ L/cm。6.如权利要求1-5所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸条外部设置塑料卡盒，塑料卡盒上依次设置凹孔和观测口，所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的质控线和检测线在观测口对应处。7.如权利要求1-6中任一权利要求所述白色念珠菌核酸层析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤: ` 1)取出含有PCR反应液的反应管，待溶化后2000转/分离心30秒； `2)向反应液管中加入2μL样品DNA,混匀； `3)将上述反应管置于普通PCR仪中，95°C变性3min后，95°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，进行30个循环，之后72°C延伸lOmin，完成PCR扩增； ` 4)将上述10μ L的扩增产物与90 μ L的样品稀释液进行混合； ` 5)取出试纸条平放于水平桌面上，将上述混合液加在试纸条样品孔中； ` 6)反应IOmin后，根据试纸条层析情况判断检测结果，完成样本检测； 结果判定:出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在白色念珠菌；仅出现一条红线(在质控线)，则样品中不存在白色念珠菌。8.一种白色念珠菌核酸层析检测试剂盒在检测样品中白色念珠菌中的应用。全文摘要本专利技术公开了白色念珠菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用，属于分子生物学和免疫学领域。本专利技术是将分子生物学的聚合酶链式反应技术和免疫层析技术进行结合，实现对白色念珠菌的快速检测。本专利技术试剂盒包括PCR扩增及试纸条检测共二部分。其中通过对引物进行特定修饰，并在试纸条制备中选择相应的包被物和标记物，反应过程中形成一个特异的复合物，实现分子生物学技术和免疫层析技术的结合，达到对白色念珠菌特异扩增产物的检测，与传统生化方法相比大大节省了检测时间，简化操作步骤，以达到快速、高效、准确的检测和筛选目的。在临床检测和筛选白色念珠菌的过程中发挥重要作用。文档编号C12Q1/68GK103194536SQ20131006830公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日专利技术者何艳玲, 王丽丽, 刘沛, 于重楠 申请人:北京陆桥技术有限责任公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白色念珠菌核酸层析检测试剂盒，包括PCR反应液和试纸条，所述试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成；其特征在于试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F为5’TTGGTGGTGGTAGACATAGA3“，下游引物R为5“TCAGAACACTGAATCGAAAG3“；所述上游引物F5’端标记生物素，下游引物R5’端标记地高辛；所述结合垫上包被胶体金颗粒标记的鼠抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜上有包被亲和素的检测线和包被羊抗鼠抗体的控制线。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何艳玲，王丽丽，刘沛，于重楠，
申请(专利权)人：北京陆桥技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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