本发明专利技术公开了一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域，所述试剂盒包括样品稀释液，酶标板和新霉素金标快速检测条，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述金标结合垫是胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有二条检测线和一条质控线，通过胶体金免疫层析技术将新霉素抗体和抗原的反应以有色反应显现出来，检测过程中可通过两种检测线颜色的变化判定乳制品中是否存在新霉素残留及其残留量范围。本发明专利技术的检测试剂盒能够实现残留物的半定量检测，检测方法简单、时间短，检测成本低，检测范围广，检测结果精确可靠，可广泛应用于食品中新霉素半定量检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域，所述试剂盒包括样品稀释液，酶标板和新霉素金标快速检测条，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述金标结合垫是胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有二条检测线和一条质控线，通过胶体金免疫层析技术将新霉素抗体和抗原的反应以有色反应显现出来，检测过程中可通过两种检测线颜色的变化判定乳制品中是否存在新霉素残留及其残留量范围。本专利技术的检测试剂盒能够实现残留物的半定量检测，检测方法简单、时间短，检测成本低，检测范围广，检测结果精确可靠，可广泛应用于食品中新霉素半定量检测。【专利说明】新霉素半定量金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术属于免疫学领域，涉及快速检测食品中氨基糖苷类抗生素新霉素残留的试剂盒和方法。
技术介绍
随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食物的要求已不是简单的填饱肚子，而是更多的关注食品的营养和安全。由于乳制品中除含有高质量蛋白质、脂肪、碳水化物外，还含有大量维生素和矿物质，被公认为迄今为止的一种比较理想的食品，因此乳和乳制品已成为人们非常喜爱的日常食品之一。从大环境上看，预计在未来三年，中国的城市化速度进一步加强，到2013年，中国的城市人口可能超过农村人口，成为真正的以城市消费带动全国消费的国家。再加上城乡人口可支配收入的不断增加以及三农政策的进一步落实和西部大开发进入攻坚阶段，在客观环境上，给中国乳业的发展提供了更加良好的平台。然而近几年来，市场上频繁出现劣质奶粉、勾兑酸奶、毒奶粉等恶性事件，乳品安全问题由此受到了全民的广泛关注。自2008年以来乳制品安全问题层出不穷，在全国乃至全世界都造成了巨大的影响，给广大消费者、乳制品行业以及众多的奶牛养殖户都带来很大的损失。乳制品的安全必须从源头抓起，通过各种检测技术对质量进行层层控制。由于乳制品生产涉及的原料数量巨大、来源众多，因此如何实现原料的快速流通，实现大量原料奶样品准确快速的筛选，是目前检测技术急需突破的难点之一。新霉素(neomycin, ΝΕ0)属于氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides),是由新霉胺和新霉二糖胺结合而成的，其抗菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、结核杆菌、抗酸菌等均有良好的抑制作用。新霉素作为一种常用兽药，常用于抑制畜禽的细菌性胃肠道感染。随着新霉素在国内外养殖业中越来越广泛地应用，其在动物源性食品中的残留问题也日益突出。当其残留量超过一定范围时会对人和动物产生潜在的耳毒性和肾毒性，给人类健康造成了很大威胁。我国农业部235号公告(2002)规定的新霉素最高残留限量为:牛奶、羊奶500 μ g/kg,鸡蛋SOOyg/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肌肉、脂肪、肝脏500 μ g/kg，牛、羊、猪、鸡、火鸡、鸭的肾脏10000 μ g/kg。目前，新霉素的残留检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法和免疫学测定法。这几种方法各有优势，但都不能用于大量样品的快速筛选检测。免疫层析测试技术是九十年代初发展起来的一项新技术，因其具有简便、快速、直观、敏感、高特异性等特点，在临床诊断等诸多领域已得到广泛应用，主要用于快速检测血清或尿样中的抗原成分；也可用于检测样品中的致病菌和其它有害成分等。目前也已在该方法灵敏度高和特异性强，反应快速，操作简便，不需任何特殊仪器设备，适用于大量样品的快速筛查和现场检测。中国专利CN102778563A公开了一种胶体金试纸条，该试纸条由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠黏贴在塑料衬板上构成，硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，金标垫包被有胶体金标记的能识别新霉素，阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体。该专利技术还公开了一种胶体金试纸条的使用方法及其在新霉素残留检测中的应用。该专利技术可用于对牛奶、鸡肉、猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝等组织样品进行新霉素残留快速检测，最低检测限为500 μ g/L，但低于农业部235公告中对新霉素在牛奶中的残留限量400ng/kg的规定，且不能够进行半定量检测。综上所述，现有免疫层析技术的应用仍然存在无法实现残留物的半定量检测、检测方法繁琐、检测耗时长、在实际工作中应用局限性大等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种食品中新霉素半定量快速检测试剂盒，利用免疫层析技术实现牛奶等样品中新霉素残留的半定量检测，使之具备当前快速检测产品所有优点的同时能够实现残留物的半定量检测，并且检测方法简单、时间短，可广泛应用于实际工作，为新霉素的残留检测提供了一种更安全、更简便的检测试剂盒及其检测方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种新霉素半定量金标快速检测试剂盒，包括样品稀释液、酶标板和试纸条，所述试纸条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上，样品垫和金标抗体结合垫上包被有MAX线。所述金标抗体结合垫上包被胶体金颗粒标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上包被有两条检测线(T线)和一条质控线(C线)，靠近金标抗体结合垫一端的为T1线，T1上包被有低浓度的新霉素-蛋白偶联物，靠近吸水垫一端的为T2线，T2线上包被有高浓度的新霉素-蛋白偶联物，浓度分别为0.05mg/mL和0.lmg/mL，包被量为I μ L/cm ；所述质控线为能特异性认识单克隆抗体的羊抗鼠单克隆抗体,浓度为lmg/mL,包被量为I μ L/cm ；所述试纸条的制备方法包括如下步骤:一、金标抗体结合垫的制备1.空白胶体金的制备:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒为25nm的胶体金溶液，具体方法为:在带有磁力搅拌子的三角烧瓶中加入97.5ml双蒸水和Iml 1%氯金酸溶液加热至沸腾并持续沸腾3?5min后，加入1.5mLl%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态IOmin后停止加热，将烧瓶中的搅拌子取出，溶液置室温充分冷却后，冷藏备用；2.胶体金标记抗体的制备:取空白胶体金溶液100ml，加入浓度为0.lg/L的碳酸钾溶液400?450 μ L，匀速缓慢搅拌7?IOmin后，在搅拌状态下逐滴加入稀释好的待标记抗体，ImL胶体金颗粒标记新霉素单克隆抗体的量为3ng，继续搅拌30min后，离心，吸除上清，沉淀用金标抗体重悬液充分重悬；所述金标抗体重悬液由四硼酸钠、硼酸、蔗糖以及牛血清白等，其主用作用为将经离心后沉淀下来的胶体金标记抗体重新溶解并保证抗体应有的特性及其稳定性。3.金标抗体结合垫的制备:将重悬好的金标抗体用金标抗体重悬液进行对倍稀释后，按每条2ml的量包被于尺寸为30*lcm玻璃纤维素膜上，37°C干燥过夜，干燥后成金标抗体结合垫，于密封避光干燥处保存，使用时取出。二、硝酸纤维素膜上T、C线的包被1.新霉素-蛋白偶联物的制备取16mg NEO (新霉素)溶于ImL PBS中，20mg BSA (牛血清白蛋白)溶于ImL PBS中，将NEO溶液加入BSA溶液中放在磁力搅拌器上搅拌，取EDC (水溶性碳化二亚胺)30mg溶于1.5mL PBS中，将EDC液逐滴加入上述反应液中，搅拌反应2h，再将IOmg EDC溶于0.5mLPBS中，逐滴加入，室温搅拌反应24h.。将反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新霉素金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括稀释液、酶标板和试纸条，所述试纸条包括样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的新霉素单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜中部包被有两条检测线和一条质控线，两条检测线分别设置有能与金标新霉素单克隆抗体进行特异性结合的不同浓度的新霉素蛋白偶联抗原，质控线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王丽哲，唐慧林，何艳玲，赵瑜，王丽丽，于重楠，刘敏，李瑾，
申请(专利权)人：北京陆桥技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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